响应面法优化刺梨果总多酚提取工艺

刘 丹，江 帆，赵 丽，安崇惠

（1.贵州省食品药品检验所，贵州贵阳 550004；2.贵州师范大学，贵州贵阳 550001；3.贵阳青青生物科技有限公司，贵州贵阳 550001）

近年来，通过对刺梨果化学成分的研究发现，刺梨果中含有多种生物活性成分，如多酚类、黄酮类、氨基酸和维生素等[1-7]。

刺梨多酚是从刺梨果实中发现的生物活性成分之一，研究证明其是刺梨果中主要的抗氧化活性物质之一[8-9]。目前提取多酚的方法主要是超声波辅助提取，该方法具有缩短提取时间、减少溶剂消耗的优点。此外，超声波辅助提取可以避免热损伤和减少生物活性物质的损耗并适合在较低的温度下使用[10]。在提取过程中，提取率受多个独立的变量影响。因此，优化刺梨多酚的提取方法是必要的。响应面法是统计和数学技术的有效集合，它可以很好地开发和优化复杂的流程，也便于使用[11]。响应面法的主要优点是减少评估多个参数及其相互作用的试验所需的试验次数，并产生了一个数学模型，能够找出最佳值[12]。本研究使用响应面法优化提取多酚的3个变量，即超声提取时间、乙醇体积分数、液料比[13]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺梨果由龙里刺梨基地提供，选取无病虫害的刺梨果，去籽、冷冻干燥、粉碎过1号筛待用。没食子酸对照品（批号：110831-201204；纯度≥89.9%），中国药品生物制品检定所；乙醇、Na2CO3等常规试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ALC-210.4电子天平（北京赛多利斯）；CARY100Bio紫外-可见分光光度计（美国瓦里安）；DY-H4-型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备）；移液枪（普兰德上海）；80-2台式低速离心机（上海医疗器械集团）；石英比色皿（江苏晶玻玻瓶）；GZX-GFC-101-2-BS型电热恒温鼓风干燥箱（上海博泰实验设备）。

1.3 试验方法

1.3.1 刺梨多酚的提取

称取刺梨果样品1.0 g，选择乙醇作为提取溶剂，超声辅助提取刺梨果总多酚一定的时间，3 000 r·min-1离心15 min，取上清液定容至25 mL。

1.3.2 标准曲线的绘制及多酚含量的测定

称取没食子酸对照品适量，制成0.899 mg·mL-1的没食子酸对照品溶液。取没食子酸对照品溶液0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL、1.3 mL、1.5 mL和1.7 mL于25 mL量瓶中，加入F-C试剂5.5 mL，充分摇匀，加入7%碳酸钠溶液7 mL，80 ℃水浴反应50 min，空白组以水代替样品，在765 nm处测定吸光度，以没食子酸质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，得回归方程Y=7.119 6X-0.339 5（R=0.999 3），线性范围为2.5～6.1 mg·L-1。以没食子酸建立的标准曲线为参照，计算刺梨多酚的含量，并计算提取率[14]。

1.3.3 单因素试验

（1）乙醇体积分数考察。固定提取条件为液料比30∶1（mL∶g），超声提取时间40 min，分别考察乙醇体积分数30%、40%、50%、60%、70%和80%[15]对总多酚提取率的影响。

（2）超声提取时间考察。固定提取条件为液料比25∶1（mL∶g），乙醇体积分数60%，考察超声提取时间 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min对总多酚提取率的影响

（3）液料比考察。固定提取条件为乙醇体积分数60%，超声提取时间40 min，设置液料比（mL∶g）为 5∶ 1、10∶ 1、15∶ 1、20∶ 1、25∶ 1和30∶1，考察液料比对总多酚提取率的影响。

1.3.4 响应面试验

基于单因素对提取效率的考察结果，设计3因素3水平的Box-Behnken中心组合试验优化提取工艺，每组设定3个重复试验，对提取条件进行优化，设计方案见表1。

表1 Box-Behnken试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数考察结果

由图1可知，随着乙醇体积分数的增加，总多酚的提取率也逐渐增大，乙醇体积分数为60%时总多酚提取率最大，之后随着乙醇体积分数的增加，提取率反而降低。可能是因为乙醇利于含羟基的多酚析出，在乙醇体积分数大于60%时，被一些更易溶的醇溶性杂质干扰，抑制了多酚类化合物的溶解。因此选择乙醇体积分数为60%左右。

图1 乙醇体积分数对提取率的影响

2.1.2 超声提取时间考察结果

由图2可知，总多酚提取率随着超声提取时间的延长先增大然后减小，超声提取时间为40 min时，总多酚提取率最高，可能是因为长时间的超声提取可使多酚扩散出来，但过长时间的超声，破坏了多酚类化合物的酚羟基结构，导致提取率下降。故选择超声提取时间为40 min左右。

图2 超声提取时间对提取率的影响

2.1.3 液料比考察结果

由图3可知，增加液料比，增加了传质动力，增大了提取溶剂与反应物间之间的浓度差，多酚更易溶出，当液料比达到15∶1（mL∶g）后，提取率已呈现较为稳定的状态，考虑到液料比太高不利于后续的浓缩以及纯化工作，选择15∶1（mL∶g）左右为提取时的液料比。

图3 液料比对提取率的影响

2.2 响应面试验

3因素3水平17组响应面试验设计及试验结果见表2。通过二次多元回归拟合得到3个实验试验因子对刺梨果总多酚提取率（Y）影响的回归模型，即Y=13.07+0.041X1+0.39X2+0.14X3-0.19X1X2+0.038X1X3-0.05X2X3-0.5X12-0.55X22-0.36X32，由回归方程可知，对多酚提取率影响最大的是超声时间。

表2 响应面设计编码试验

该模型方程方差分析和显著性检验见表3。由表3可知，回归方程中，一次项中X2极显著，X1和X3差异都不显著，说明超声提取时间对刺梨果总多酚的提取率影响最大，乙醇体积分数和液料比对刺梨果总多酚提取率的影响较小。乙醇体积分数和超声提取时间的交互项P值差异显著，其他两两交互项均未达到显著水平。3个因素的二次项和模型的P值差异均极显著，模型的决定系数R2=0.978 1，说明97.81%响应值的变化能被该模型解释，表明该模型具有较高的拟合度和可信度，可应用此模型对试验结果进行分析和预测。

表3 多项式预测模型方差分析

回归方程由三维响应面和二维等高线图表示。可视化反映了各变量的试验水平和两个测试变量之间的相互作用的关系。圆形等高线图表示相应的变量之间相互作用可忽略不计，椭圆形等高线图表示相应的变量之间的相互作用显著[16]。试验中，乙醇浓度、超声提取时间和液料比对提取率影响的结果见图4。

由图4可知，AB的等高线图为椭圆形，说明两因素之间交互作用显著，即超声时间和乙醇体积分数对总多酚得率的影响显著，其他因素的等高线图接近于圆形，说明其他因素的交互作用影响不显著。回归方程模型的方差分析结果与响应面图反应的各因素之间交互作用结果一致。通过软件分析得到最佳乙醇体积分数59.59%、最佳超声时间47.37 min、最佳液料比16.08∶1.00。在此条件下总多酚提取率达到13.16%。

图4 各因素交互作用对总多酚提取率的响应面图和等高线图

为验证响应面优化的方法的可靠性，采用最优提取条件进行提取试验，同时将总多酚最佳提取条件修正为乙醇体积分数60%、超声时间48 min、液料比16∶1。重复3次验证试验，总多酚平均提取率为13.20%，预测值与实测值接近，见表4。因此，该工艺优化后的参数具有准确性和可靠性，可应用到实际操作中。

表4 验证试验结果

3 结论

试验选择响应面分析法优化刺梨果多酚的最佳提取条件，经试验分析，刺梨果多酚的最佳提取条件为超声提取时间48 min，乙醇浓度60%和液料比16∶1。在此条件下，提取率的平均提取率为13.20%，与预测值相吻合，说明该方法可以用于更好地开发利用刺梨果多酚资源。