副干酪乳杆菌ET-22连续传代1 000代的稳定性研究

刘福东，桑跃，洪维鍊，赵雯，张红星

（1.北京农学院食品科学与工程学院，北京 102206；2.甘肃农业大学，兰州市 730070；3.内蒙古乳业技术研究院有限责任公司，呼和浩特 010110；4.内蒙古伊利实业集团股份有限公司，呼和浩特 010110）

益生菌（Probiotics）是指通过摄入一定的数量，对宿主的身体健康有益的活的微生物。益生菌具有调节肠道菌群平衡、提高机体免疫力、促进营养物质吸收、抗氧化、降血糖、降血脂、改善骨骼健康等多种益生作用[1～4]。

目前，益生菌已广泛应用于食品等各个领域，对其稳定性的研究也越来越受到关注，焦点主要集中在以下几个方面：①益生菌添加到产品中其存活的稳定性；②益生菌的生理学特征及稳定性；③益生菌遗传和表达的稳定性。高稳定性益生菌能够更好地发挥其功效，为益生菌的加工生产以及菌株安全性提供保障[5]。

副干酪乳杆菌ET-22分离自健康人体肠道，具有免疫调节[6]、缓解肠道炎症和便秘[7,8]、促进骨骼健康[9]等多种益生功能，目前已在发酵乳制品、益生菌制剂及保健品等领域实现了应用。为研究ET-22菌株的传代稳定性，本文从细胞形态、菌落形态、活菌数、浊度、菌株发酵活力及全基因组变异情况6个方面进行了考察，对ET-22在连续传代过程中的表型特征和遗传信息稳定性进行了研究分析，以期为ET-22的产业转化应用提供一定的理论参考和指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

副干酪乳杆菌ET-22由内蒙古伊利实业集团股份有限公司提供，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.15077。

1.1.2 试剂与仪器

试剂：MRS培养基，北京陆桥技术股份有限公司产品；脱脂乳粉，恒天然合作社集团有限公司产品；葡萄糖、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、琼脂粉等常用试剂均为国产分析纯试剂。

仪器：洁净工作台（DJ-CJ-2ND1），北京东联哈尔仪器制造有限公司产品；生化培养箱（SPX-300），宁波乐电仪器制造有限公司产品；智能高速冷冻离心机（3H16RI），湖南赫西仪器装备有限公司产品；pH计（FE28），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；超纯水系统（SMART-N），上海康雷分析仪器有限公司产品；紫外-可见分光光度计（UV-2808），尤尼柯（上海）仪器有限公司产品；全自动高压灭菌器（LDZX-75L），上海申安医疗器械厂产品；光学显微镜（CX31），日本奥林巴斯公司产品；场发射扫描电镜（SU8020），日本日立公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的连续传代培养及培养代数计算[10]

将0代副干酪乳杆菌ET-22进行长期连续传代培养至1 000代。以12h为1个传代周期，按2%（体积分数）接种量连续传代培养。副干酪乳杆菌ET-22的一个单细胞经 n次分裂增殖后细菌数为2n个。在每个传代周期（12h）内，菌体近似几何级数（2n）增殖。通过测定菌株生长曲线可知，当接种量为2%时，菌数约增长50倍，则每个周期内的生长代数（即细菌进行分裂的次数）为log250≈5.64 代。

1.2.2 细胞形态观察

菌株ET-22连续传代过程中，每培养200代，对菌株进行一次光学显微镜和扫描电子显微镜观察。

光学显微镜观察：培养周期末将培养液进行适当稀释，然后革兰氏染色，100倍油镜观察细胞形态，拍照并记录。

扫描电镜观察：培养周期末将菌液离心收集菌体，使用PBS缓冲液重悬离心2～3次，2.5%戊二醛固定菌体，临界点干燥脱水，扫描电镜观察细胞完整度和细胞表面褶皱程度，拍照并记录。

1.2.3 菌落形态观察

菌株ET-22连续传代过程中，每培养200代，即将培养液按10倍稀释法稀释到合适梯度，涂布于MRS固体培养基，37℃倒置培养48h，观察菌落形态、大小、颜色等特征，拍照并记录。

1.2.4 活菌数检测

菌株ET-22连续传代过程中，每培养200代，测定发酵活菌数一次，检测3个平行。将培养液用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，选择适当的2～3个梯度进行倾注平板，37℃倒置培养48h，选取菌落总数在30～300范围内平板作为活菌计数的指标。

1.2.5 浊度检测

菌株ET-22连续传代过程中，每培养200代，测定一次培养液浊度，检测3个平行。以未接菌的MRS培养基作为空白对照，使用紫外分光光度计检测培养液在600nm处的吸光度。

1.2.6 菌株发酵活力的测定[11]

菌株ET-22连续传代过程中，每培养200代，测定一次菌体发酵活力，检测3个平行。菌体发酵活力可以通过菌株发酵碳水化合物产生酸的量来测定，将菌体以1×107CFU/mL浓度接种于10mL灭菌脱脂乳中，37℃恒温培养24h，取出后立即放入冰浴，每样加20mL蒸馏水稀释，用0.1 mol/L NaOH滴定pH至8.50～8.55，维持30s稳定，记录消耗NaOH体积，计算样品中的乳酸浓度，换算为活力单位。

灭菌脱脂乳制作：10%脱脂乳粉，2%葡萄糖，121℃灭菌15min，急冷，4℃冰箱中存放备用。

发酵活力：以每1000万（107）个菌体细胞在以上条件下发酵1mL脱脂乳产生1μmol乳酸计为1个活力单位（U）。

1.2.7 遗传稳定性测定

菌株ET-22连续传代过程中，每培养200代，提取菌体基因组DNA一次，进行基因组重测序分析。0代菌体采用二代+三代的测序方式获得基因组完成图，200～1 000代菌体采用二代测序获得基因组扫描图，分别将200～1 000代基因组扫描图与0代基因组完成图进行比对，分析菌株ET-22在连续传代过程中遗传信息的变化。副干酪乳杆菌ET-22基因组测序委托上海美吉生物医药科技有限公司进行。

2 结果与讨论

2.1 传代过程中菌株细胞形态观察

副干酪乳杆菌ET-22属于乳杆菌属中的干酪乳杆菌组群，是革兰氏阳性菌，菌体呈杆状，长度0.9～3.1μm，单个、成对或成短链排列[12]。图1为副干酪乳杆菌ET-22在连续传代1 000代期间的显微镜照片，照片中显示ET-22在传代过程中菌体细胞均为成对或成链杆状排列，细胞形态没有发生明显变化。图2为副干酪乳杆菌ET-22在连续传代1 000代期间的扫描电镜照片，可以看出，细胞表面光滑、结构完整，不同代数细胞之间无明显差异。

图1 副干酪乳杆菌ET-22传代过程光学显微镜照片

图2 副干酪乳杆菌ET-22传代过程扫描电镜照片

2.2 菌株传代过程中菌落形态观察

图3为副干酪乳杆菌ET-22在连续传代1 000代期间的涂布平皿菌落形态照片。照片显示，不同代数副干酪乳杆菌ET-22的菌落形态一致，呈圆形，直径1～3mm，颜色为白色，表面光滑、隆起，边缘整齐，符合副干酪乳杆菌菌落特征[12]。说明副干酪乳杆菌ET-22在连续传代1 000代过程中，菌落形态无明显变化，稳定性较好。

图3 副干酪乳杆菌ET-22传代过程菌落形态照片

2.3 生长周期末活菌数变化情况

副干酪乳杆菌ET-22在连续培养1 000代期间，不同代数各菌株活菌数变化情况见表1。根据显著性分析结果显示，不同培养代数菌株活菌数无显著性差异（P〉0.05），表明随着传代次数的增加，没有改变菌株的生长特性。

表1 副干酪乳杆菌ET-22连续传代期间的活菌数变化情况

图4显示副干酪乳杆菌ET-22在连续传代培养1 000代期间活菌数的变化趋势。图中显示，不同代数各菌株的活菌数随培养代数的增加呈小幅度波动性变化，总数基本维持不变。

图4 副干酪乳杆菌ET-22连续传代期间活菌数变化趋势

2.4 生长周期末浊度变化情况

菌株发酵液的浊度变化反映总生物量的变化情况。在连续培养1 000代过程中，副干酪乳杆菌ET-22的OD600值变化情况见表2。表中显示，副干酪乳杆菌ET-22在连续传代过程中OD600值无显著性变化（P〉0.05）。

表2 副干酪乳杆菌ET-22连续传代期间OD600值变化情况

副干酪乳杆菌ET-22在连续传代期间的OD600值变化趋势如图5所示。图中显示，连续传代过程中，OD600值随培养代数的增加呈波动性变化，幅度较小，说明在本试验条件下，连续传代培养的菌体发酵液的总生物量没有随培养代数的增加而发生改变。

图5 副干酪乳杆菌ET-22连续传代期间OD600值变化

2.5 菌株发酵活力

菌株的发酵活力是评价其发酵性能的重要指标，其稳定性是开发和研制直投式发酵剂的必备条件[13]。菌株发酵活力很容易受到外界不利条件的影响，导致其生物活性降低，从而影响发酵剂的稳定性和保质期[14]。定期检测菌株在传代过程中的产酸活力变化，是菌种稳定性研究的一项重要工作，具有实际应用价值[11]。

副干酪乳杆菌ET-22在连续培养1 000代期间，不同代数各菌株发酵活力变化情况见表3。从表中可知，副干酪乳杆菌ET-22在连续传代过程中发酵活力无显著性变化（P〉0.05）。副干酪乳杆菌ET-22连续传代期间发酵活力变化趋势如图6所示，可以看出连续传代过程中，菌株发酵活力随培养代数的增加呈波动性变化，但幅度较小，说明连续传代培养的菌株发酵活力没有随培养代数的增加而发生改变。

表3 副干酪乳杆菌ET-22连续传代期间发酵活力变化情况

图6 副干酪乳杆菌ET-22连续传代期间发酵活力变化趋势

2.6 遗传信息的稳定性

细菌基因组重测序，即从头测序，是在不依赖任何参考序列的情况下对基因组进行测序，并利用生物信息学手段从头组装得到基因组序列。根据最终基因组组装的完整程度不同，分为完成图测序和扫描图测序。

本研究对0代副干酪乳杆菌ET-22进行了基因组完成图测序，结果可知ET-22全基因组总长度3 078 179bp，编码基因总数量为3 141个，其中包含60个tRNA和15个rRNA编码基因，在整个基因组水平上的平均GC含量为46.33%。

经对200～1 000代ET-22进行扫描图测序分析，并与0代完成图进行比较基因单核苷酸多态性（SNP）分析（表4），发现ET-22在0～600代内SNP、MNP、IMS、DEL、INV以及DUP位点均为0，800～1 000代内仅出现最多4个SNP位点。

表4 副干酪乳杆菌ET-22连续传代期间基因组突变信息统计

SNP分析是评价菌株遗传信息差异的重要手段[15-16]，相比较传统的16SrRNA 基因[17]、pheS/atpD 功能基因[18]、平均核苷酸一致性（ANI）[19]、随机扩增多态性DNA（RAPD）[20]等分析技术，分析信息更全面，应用范围更广。PIGHTLING等人认为SNP差异小于21是判断为同一菌株的标准[21]，副干酪乳杆菌ET-22在传代过程中SNP差异较小（SNP＜5），符合同一菌株标准，表明菌株在连续传代1 000代期间遗传信息维持稳定。

3 结论

菌株生理和遗传稳定是其商业化应用的基础，近年来国内外学者对多种益生菌及发酵剂菌株的遗传稳定性进行了大量研究。乌云等[11]考察了1株益生乳酸菌P-8在连续传代1 000～2 000代期间的表型特征变化，表明P-8经过长时间不间断连续传代其表型特征稳定。刘天伟等[20]研究了乳酸菌发酵剂的遗传稳定性，结果表明发酵剂在长时间储藏和传代培养过程中基因组信息以及蛋白表达无明显变化，具有较好的遗传稳定性。

本文对副干酪乳杆菌ET-22连续传代1 000代期间的细胞形态、菌落形态、活菌数、浊度、菌株发酵活力和全基因组变异系数的变化情况进行了检测，结果表明ET-22表型特征和遗传学信息在长期传代过程中具有良好的稳定性。本文结论可以为副干酪乳杆菌ET-22的产业转化应用提供坚实的理论基础和指导，也可为其他益生菌株和发酵菌株的开发提供实践参考。