miR-138通过靶向LCN2在七氟醚诱导的大鼠认知障碍中的作用及机制*

郑育秀 刘丽丽 黄泽波 王涛 刘莉芳

(海南医学院第二附属医院麻醉科，海南 海口 570311)

术后认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction，POCD)是一种神经变性疾病，以长期POCD综合征为特征[1]。手术和麻醉是导致认知障碍的主要原因，七氟醚麻醉可减少海马区的神经发生和神经元存活[2]。此外，七氟醚麻醉可引起神经毒性和POCD[3]。因此，有必要探索一种针对七氟醚麻醉诱导的POCD的有效神经保护方法。越来越多的证据[4]表明，手术麻醉诱导的认知障碍与大脑发育相关的多种基因表达的改变有关。近年来，微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)的失调与麻醉相关的POCD有关[5]。MiRNAs是一种小的非编码RNA，通过抑制转录本的翻译或诱导靶mRNA的降解负向调控基因表达。此外，越来越多的miRNAs已被证明与麻醉剂诱导的海马细胞凋亡有关[6-7]。由于miRNAs在细胞死亡和分化的调节中具有重要作用，鉴定参与麻醉剂暴露引起认知障碍的miRNAs并了解其功能分子机制至关重要。有一项研究[8]筛选了七氟醚暴露后差异表达的miRNAs，研究表明七氟醚治疗后，miR-138是显著下调的miRNAs之一。然而miR-138在七氟醚麻醉诱导中的功能性分子机制仍未知。Janus激酶2/信号转导和转录激活因子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信号通路参与了许多生理过程，包括炎症、增殖、分化和发育，它可能有助于驱动神经元对细胞因子的生存反应[9]。此外，JAK2/STAT3是POCD发展的潜在机制。李等[10]证明Kappa阿片受体激动剂对大鼠POCD具有神经保护作用，部分是通过抑制JAK2/STAT3通路介导的。在阿尔茨海默氏症的动物模型中，激活JAK2/STAT3通路改善空间学习和记忆[11]。总之，这表明miR-138可能通过JAK2/STAT3信号通路参与七氟醚麻醉诱导的POCD。因此，本研究通过七氟醚治疗建立认知障碍大鼠模型，进一步探讨miR-138在七氟醚麻醉诱导认知障碍中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 7周龄SD大鼠(240±10) g 90只，将其饲养在标准条件的实验室中[温度(22±1)℃、湿度(60±5)%、光照/黑暗周期为12 h]。大鼠可随意获得水和食物。所有实验均经我院伦理委员会批准，并遵循国家卫生研究院关于动物护理和使用的指南进行。

1.2 主要试剂及仪器 七氟醚(上海恒瑞制药有限公司)；miR-138 mimic、NC mimic、pcDNA-LCN2腺病毒载体合成[汉恒生物科技(上海)有限公司]；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；逆转录系统、SYBR Premix Ex Taq II、双荧光素酶报告基因检测试剂盒[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]；ELISA试剂盒(Abcam公司)；BCA试剂盒(武汉博士德生物有限公司)；脂质运载蛋白2(Lipocalin-2，LCN2)、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、GAPDH (Abcam公司)。Morris水迷宫视频分析系统(上海玉研科学仪器有限公司)；分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司)；多功能酶标仪[美谷分子仪器(上海)有限公司]；显微镜(Leica公司)；凝胶成像分析系统(Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及七氟醚麻醉 将SD大鼠随机分为对照组(20只)、七氟醚组、七氟醚+NC mimic组、七氟醚+miR-138 mimic组、七氟醚+miR-138 mimic+Vector组、七氟醚+miR-138 mimic+pcDNA-LCN2组。选用70只大鼠构建七氟醚麻醉诱导的认知障碍大鼠模型，将大鼠置于一个以5 L/min的速率供应2.5% 的七氟醚和空气-氧气混合物(吸入氧气分数为40%)的麻醉室内，持续吸入6 h。实验过程中用麻醉气体监测仪连续监测七氟醚和氧气的浓度，并测量直肠温度维持在37℃左右。其中，20只大鼠为七氟醚组，剩余50只七氟醚诱导的大鼠侧脑室分别注射10 μL NC mimic、miR-138 mimic以及共注射miR-138 mimic+Vector和miR-138 mimic+pcDNA-LCN2腺病毒悬液，记为七氟醚+NC mimic组(20只)、七氟醚+miR-138 mimic组(20只)、七氟醚+miR-138 mimic+Vector组(5只)、七氟醚+miR-138 mimic+pcDNA-LCN2组(5只)。对照组大鼠：吸入空气-氧气混合物6 h，共20只。

1.3.2 Morris水迷宫实验 通过实验评估暴露于七氟醚和常规空气中大鼠的学习和记忆能力。每组大鼠被训练在圆形水池中游泳5天。水池中放置一个直径约10 cm、距水面2 cm的隐藏圆形平台。将大鼠从不同位置(北、南、东、西)放入水中，实验要求大鼠在60 s内游泳并找到平台，当大鼠在规定时间内无法找到隐藏的平台时，则将大鼠引导到平台上，休息10 s再进行下一次实验。采用ANY-maze动物行为视频跟踪系统记录第5 d每只大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)、穿越平台次数。

1.3.3 HE染色 HE染色检测大鼠海马神经元的病理变化。各组大鼠深度麻醉后，逐层解剖暴露心脏，先灌注0.9%生理盐水，再灌注4%多聚甲醛。灌注成功后解剖脑组织，固定后用石蜡包埋并切片。根据苏木精-伊红(HE)染色试剂盒说明书进行染色，苏木精染色细胞核，伊红染色细胞质。最后，在显微镜下观察海马神经元的形态并拍照。

1.3.4 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR) Morris水迷宫实验结束后，通过断头处死大鼠。在冰上快速解剖海马组织，使用研钵将组织磨成粉末。分别用Trizol试剂从海马组织中提取总RNA。使用分光光度计检测RNA的浓度和纯度。使用反转录试剂盒将1 μg的总RNA逆转录为cDNA。用SYBR Premix Ex Taq II检测miR-138和LCN2的表达水平。GAPDH和U6分别用作LCN2和miR-138的内部对照，使用2-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量。基因引物序列表，见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.5 Western blotting 大鼠海马组织在含有1%苯甲磺酰氟的RIPA裂解缓冲液中匀浆。离心后收集上清液。采用BCA蛋白测定法测定蛋白浓度。蛋白质样品经15% SDS-PAGE分离。随后，蛋白质被转移到PVDF膜上。在室温下，将膜在5%脱脂牛奶封闭1 h，随后与一抗在4℃孵育过夜，然后与相应的二抗在37℃孵育1 h。GAPDH作为内参。用化学发光试剂显现条带，并在Bio-Rad凝胶成像系统下观察。利用Image J软件分析目标条带的灰度值。

1.3.6 酶联免疫吸附实验(ELISA) 将每组大鼠的冷冻海马标本与适量生理盐水混合。充分匀浆后，在4℃下以8000 g的速度离心10 min。收集上清，根据试剂盒说明书使用ELISA试剂盒测定海马组织中IL-6、TNF-α和IL-1β的表达水平。

1.3.7 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记法(TUNEL法) 使用TUNEL染色试剂盒检测大鼠海马神经元凋亡。取TUNEL试剂盒中试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按1：9混合，覆盖切片。TUNEL标记后，用4-6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)作为荧光示踪剂复染海马神经元以检测细胞核。脑凋亡细胞均为TUNEL阳性，荧光显微镜下为绿色荧光标记。

1.3.8 双荧光素酶报告基因 将LCN2的野生型(WT-LCN2)和突变型(MUT-LCN2)3’UTR构建到pMIR-REPORT萤火虫荧光素酶载体中，该载体包含miR-138的预测结合位点。将293T细胞以1000个细胞/孔的密度接种到96孔板中。然后使用Lipofectamine 2000共转染100 nM miR-138 mimic或NC mimic。转染48 h后，使用双荧光素酶报告分析试剂盒测定荧光素酶活性，并用肾素荧光素酶活性标准化。实验重复3次。基因序列：miR-138序列为GCCGGACUAAGUGUUGUGGUCGA；WT-LCN2序列为AUCACCUGGCUGCCCCACCAGCC；MUT-LCN2序列为AUCACCUGGCUGCCCACAAGAAC。

2 结果

2.1 miR-138在七氟醚诱导的大鼠海马中的表达水平 与对照组比较，七氟醚组和七氟醚+NC mimic组大鼠海马中miR-138的表达均显著降低(P<0.05)；与七氟醚组、七氟醚+NC mimic组比较，七氟醚+miR-138 mimic组大鼠海马中miR-138的表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠海马中miR-138的表达水平

2.2 miR-138改善七氟醚诱导的大鼠空间认知能力 Morris水迷宫实验结果显示，与对照组比较，七氟醚组和七氟醚+NC mimic组大鼠逃避潜伏期均显著增加，穿越平台次数均显著减少(P<0.05)；与七氟醚组、七氟醚+NC mimic组比较，七氟醚+miR-138 mimic组大鼠逃避潜伏期显著减少，穿越平台次数显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3 miR-138减轻七氟醚诱导的大鼠海马神经元病理损伤 HE染色结果显示，对照组海马组织排列规则，未见明显的病理损伤；七氟醚组和七氟醚+NC mimic组大鼠海马神经元细胞形态不完整，核浓缩，排列紊乱松散，体积小；而七氟醚+miR-138 mimic组大鼠海马神经元的病理损伤一定程度上得到了改善，病理损伤减轻。见图3。

图3 HE染色检测各组大鼠海马神经元病理损伤(400×)

2.4 miR-138抑制七氟醚诱导的大鼠海马神经元凋亡 Western blotting结果显示，与对照组比较，七氟醚组和七氟醚+NC mimic组大鼠海马神经元凋亡数量均显著增加，cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平均显著升高，Bcl-2显著降低(均P<0.05)；与七氟醚组、七氟醚+NC mimic组比较，七氟醚+miR-138 mimic组大鼠海马神经元凋亡数量显著减少，cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平降低，Bcl-2升高，差异有统计学意义(均P<0.05)。见图4。

图4 miR-138抑制七氟醚诱导的大鼠海马神经元凋亡

2.5 miR-138抑制七氟醚诱导的大鼠海马神经元炎症反应 ELISA实验结果显示，与对照组比较，七氟醚组和七氟醚+NC mimic组大鼠中IL-1β、TNF-α、IL-6水平均显著增加(均P<0.05)；与七氟醚组、七氟醚+NC mimic组比较，七氟醚+miR-138 mimic组中IL-1β、TNF-α、IL-6水平降低，差异有统计学意义(均P<0.05)。见图5。

图5 miR-138抑制七氟醚诱导的大鼠海马神经元炎症反应

2.6 LCN2是miR-138的靶基因 双荧光素酶报告实验显示，与LCN2-MUT和miR-138 mimic共转染的细胞相比，miR-138 mimic与LCN2-MUT共转染的细胞相对荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。此外，RT-qPCR和Western blotting结果显示，与对照组比较，七氟醚组和七氟醚+NC mimic组中LCN2水平均显著升高，而七氟醚+miR-138 mimic组LCN2水平较七氟醚组、七氟醚+NC mimic组显著降低(均P<0.05)。见图6。

图6 LCN2是miR-138的靶基因

2.7 miR-138靶向LCN2对七氟醚诱导的海马中JAK2/STAT3通路蛋白及凋亡蛋白的影响 与七氟醚+NC mimic组比较，七氟醚+miR-138 mimic组中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平降低，Bcl-2水平升高，p- JAK2和p-STAT3蛋白水平

升高(均P<0.05)；与七氟醚+miR-138 mimic组、七氟醚+miR-138 mimic+Vector组比较，七氟醚+miR-138 mimic+pcDNA-LCN2组中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平均显著升高，Bcl-2水平降低，p-JAK2和p-STAT3蛋白水平均显著降低，差异有统计学意义(均P<0.05)。见图7。

图7 各组大鼠JAK2/STAT3通路蛋白及凋亡蛋白的表达

3 讨论

POCD发病机制复杂，由麻醉和手术及多种因素引起的神经功能衰退，包括中枢神经系统的炎症反应和凋亡。七氟醚是一种常用的吸入麻醉剂，引起的POCD的机制与神经炎症和细胞凋亡密切相关[12]。因此，深入了解七氟醚诱发POCD的机制，寻找合适的靶点和机制来减少甚至消除POCD的发生是研究的重点。

据报道，许多miRNAs与麻醉诱导的POCD有关。其中，在七氟醚治疗后，miR-96被证明可促进海马神经元凋亡，加重七氟醚对海马神经元和认知功能的影响[13]。此外，miR-34a可促进七氟醚诱导的海马细胞凋亡[14]。然而，一些miRNA对七氟醚介导的细胞凋亡具有神经保护作用。研究发现miR-665抑制七氟醚诱导的细胞凋亡，提示具有潜在的神经保护作用。有研究[8]报道，miR-138是七氟醚暴露后下调最显著的miRNA之一。本研究结果表明，与对照组大鼠相比，接受七氟醚治疗的大鼠海马组织中miR-138水平降低。

海马体是学习、记忆以及其他基本认知能力的关键大脑区域[15]。因此，本实验重点研究海马体。七氟醚暴露可导致空间学习和记忆损伤[16]。本研究建立了七氟醚诱导的动物模型，通过Morris水迷宫实验评估认知能力，结果发现暴露在七氟醚中会导致空间学习和记忆的缺失，表现为逃避潜伏期显著增加，穿越平台次数显著减少；此外，七氟醚暴露导致海马神经元严重损伤，这与之前的报道[17]关于麻醉药引起的认知障碍是一致的。miR-138可以减少潜伏期时间，增加穿越平台次数，海马神经元的病理损伤减轻，这些结果表明miR-138可能在七氟醚麻醉诱导的大鼠认知障碍中具有重要作用。

研究[18]表明，七氟醚麻醉引起的大脑结构和神经POCD的变化是由激活的caspase-3的表达变化和神经细胞凋亡诱导引起的。Bcl-2家族的蛋白质，如Bax和Bcl-2被发现是调节线粒体膜对细胞色素C的通透性的分子，而Caspase-9被发现在细胞死亡中起核心作用[19]。抗凋亡蛋白Bcl-2在神经退行性疾病、缺血、氧化应激和创伤等多种逆境下调节神经元凋亡中发挥着关键作用，促凋亡Bax是许多神经细胞群体中诱导凋亡和坏死的重要因素[20-21]。而miR-138治疗则改善七氟醚诱导的神经元凋亡，这可以通过TUNEL染色以及凋亡蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax水平的降低以及Bcl-2蛋白水平的升高来证明，提示miR-138通过抑制中枢神经细胞凋亡发挥神经保护作用。然而，POCD病的发病机制非常复杂，可能包括吸入麻醉药的直接作用、手术创伤的后果以及炎症反应。针对炎症因子分布，有证据[22]表明，海马中促炎症因子和抗炎因子水平的变化与七氟醚诱导的POCD有关。此外，我们还证明了miR-138对炎症的抑制作用，包括降低IL-6、TNF-α 、IL-1β的水平。虽然miRNA在七氟醚诱导的神经元凋亡和炎症中发挥不同的作用，但miRNA的表达与七氟醚诱导的神经元进展密切相关。这些结果表明miR-138可以作为海马凋亡和炎症的抑制因子，减轻七氟醚麻醉诱导的认知障碍。

为了进一步确定miR-138在七氟醚诱导的认知障碍中的作用机制，本研究证明了miR-138可以与LCN2的3′-UTR结合并负调控其水平。在其他疾病中，miR-138-5p和LCN2表现出与我们的结果一致的调节关系。如miR-138可以负调控LCN2的表达，从而抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡[23]。LCN2是分泌型脂蛋白家族的成员，参与先天免疫、细胞凋亡和肾脏发育等多种细胞过程[24]。既往研究[25]还表明LCN2缺失会减弱海马神经元死亡和认知能力下降。此外，脑室内注射重组LCN2蛋白引起CA1神经元死亡和POCD。据报道[26]LCN2通过JAK2/STAT3通路抑制神经炎症损伤，在脑缺血中发挥了强大的治疗作用。研究[27]发现JAK2/STAT3通路与认知功能有关，如右美托咪定通过JAK2/STAT3途径减轻异氟醚诱导的认知障碍；山参处理通过激活JAK2/STAT3显著减轻了通常由三甲基素引起的认知障碍[28]。目前的研究发现，异氟醚麻醉不仅增加了Bax的表达，降低了Bcl-2的表达，而且还增加了p-JAK2和p-STAT3蛋白的水平。这些结果表明七氟醚诱导的大鼠海马神经元凋亡与JAK2/STAT3通路的激活有关。此外，miR-138治疗抑制了神经元的凋亡，并且p-JAK2和p-STAT3蛋白的水平降低，而LCN2过表达又一次逆转这一结果，表明miR-138靶向LCN2通过JAK2/STAT3通路抑制七氟醚麻醉诱导的海马神经元凋亡。

4 结论

本研究结果提示，miR-138 靶向LCN2通过JAK2/STAT3信号通路对七氟醚麻醉诱导的大鼠POCD具有神经保护作用，为七氟醚麻醉诱导的认知障碍治疗提供了新的靶点。然而，miR-138在七氟醚麻醉诱导的认知障碍中的分子机制要进一步阐明，仍需进一步深入研究。