基于OPG/RANKL探讨地诺单抗对老年性骨质疏松大鼠血管钙化的作用机制

熊燕 何朝霞 颜永强 张译文 万沁,4

(1西南医科大学临床医学院，四川 泸州 646000；2四川省医学科学院 四川省人民医院温江医院健康管理(体检)中心；3遂宁市中医院脑病科；4西南医科大学附属医院内分泌科)

受我国人口结构改变的影响，一些与年龄相关疾病的发病率呈明显升高趋势，其中骨质疏松、血管钙化均为常见老年退行性疾病，严重降低老年患者生活质量〔1〕。老年性骨质疏松属于原发性骨质疏松，而血管钙化是血管老化的一种表现，与钙盐沉积、血管弹性降低有关，极易导致斑块、血栓的形成，引发更加严重的心脑血管疾病〔2〕。以往研究认为血管钙化属于不可逆的自然衰老过程，与骨质疏松之间无明显关系，但是随着医学临床的不断发展，有研究发现老年性骨质疏松患者存在明显血管钙化情况，指出血管钙化属于可逆性病变，且可通过一定措施进行预防〔3〕。骨保护素/核因子кB活化因子受体配体(OPG/RANKL)信号通路成为当今医学研究的热门课题，而该通路在血管钙化及骨质疏松疾病发生及发展中均起到非常重要的作用〔4〕。RANKL由成骨细胞表达，可以与RANK结合后促进破骨细胞成熟，阻碍破骨细胞凋亡，成骨细胞分泌的POG会竞争性结合RANKL，对于破骨细胞生成产生抑制作用，阻碍骨吸收，增加骨密度〔5〕。OPG/RANKL信号通路不仅对于骨细胞分化成熟可起到介导作用，对于血管内钙沉积同样起到关键作用。地诺单抗是RANKL的单克隆抗体，对于RANKL的作用起到抑制效果，改善骨吸收及骨减少。有报道指出，地诺单抗不仅可提高骨质疏松大鼠骨密度，还可以降低血钙沉积。本研究通过分析地诺单抗对于OPG/RANKL信号通路的影响，进一步探究其在骨质疏松症大鼠血管钙化中的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 78只雄性CD大鼠鼠龄均为7月龄，体重500～650 g，单笼饲养，温度23℃，湿度45%，均自由摄食、饮水，采用无特定病原体级(SPF)饲料进行饲养，每周进行一次笼具、消毒垫更换。本研究所使用大鼠均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。实验已获得动物伦理委员会批准。

1.2实验试剂及器械 试剂：大鼠Ⅰ型胶原联羟基末端肽(CTX-Ⅰ)试剂盒、大鼠骨钙素(BGP)试剂盒、大鼠Ⅰ型前胶原N-端前肽(PⅠNP)试剂盒均由上海酶联生物有限公司提供；茜素红S、四甲基乙二胺(TEMED)、戊巴比妥那购于Sigma公司(美国)；RANKL抗体、β-actin及OPG抗体购于millipore公司(美国)；羊抗兔二抗购于abcam公司(英国)；十二烷基硫酸钠(SDS)、羟甲基氨基甲烷(Tris)、细胞裂解液及BCA蛋白浓度测定试剂盒北京生物制品研究所有限责任公司等。仪器：冰箱购于青岛海尔股份有限公司；离心机购于上海安亭科学仪器厂；双能X现吸收仪购于Hologic公司(美国)；电泳仪、电转仪、酶标仪BIO-RAD公司(美国)；包埋机、全自动封闭式组织脱水机Shandon公司(英国)；光学显微镜购于Olympus公司(日本)等。

1.3方法

1.3.1造模及分组 (1)大鼠进行1 w的适应性饲养后随机分为3组：空白对照组16只，假手术组16只，老年性骨质疏松模型组46只。(2)制备大鼠老年性骨质疏松模型：切除大鼠双侧睾丸，术前需进行12 h的禁食、禁水，采用戊巴比妥钠进行麻醉处理，浓度为2%，剂量为40 mg/kg，将大鼠采用仰卧位进行固定，并对术区进行脱毛，常规处理术区皮肤，切开阴囊皮肤，切口长度在1 cm左右，对睾丸进行结扎并切除，完成睾丸切除后将附睾归位，进行缝合。然后以相同方式切除另一侧睾丸。术后每日为大鼠进行青霉素腹腔注射，连续进行5 d，术后创口愈合后不进行拆线，缝合线会自动脱落。(3)造模结果验证：在术后16 w各处死6只假手术组、空白对照组及骨质疏松模型组大鼠，并对大鼠右后侧股骨进行钝性分离，剔除附着的软组织、肌肉及肌腱，使用生理盐水进行冲洗，并自然晾干。检测大鼠右后侧骨密度采用双能X线吸收仪进行，分析是否造模成功，确定造模成功后进行分组。(4)试验分组：空白对照组选取10只未做任何处理的空白大鼠；假手术组选取10只假手术处理大鼠(该组大鼠手术操作同造模组，但不切除睾丸)；骨质疏松组选取造模成功后的10只大鼠；地诺单抗干预组选取造模成功后大鼠30只，分别对其进行中、高、低剂量的地诺单抗治疗。

1.3.2治疗方法 除地诺单抗组外其他小组大鼠均进行皮下注射生理盐水 10 mg/kg，地诺单抗干预组，给予地诺单抗皮下注射，低剂量组大鼠注射剂量为5 mg/kg，中剂量组为10 mg/kg，高剂量组为20 mg/kg。每组大鼠每周进行2次注射，连续干预时间为4 w。

1.3.3样本取样 大鼠麻醉处理，取仰卧位，做胸腹纵切口，将腹主动脉及胸主动脉充分暴露。从腹主动脉取血，常规抗凝，离心处理，转速3 500 r/min。离心时间为5 min，温度为4℃，分离血清。截取一段大鼠主动脉血管，使用甲醛溶液进行固定，存储待检。对大鼠右侧股骨进行解剖分离，剔除周围组织，使用生理盐水进行冲洗，用于骨密度检测。

1.3.4样本检测 ①骨密度测定，采用双能X线吸收仪进行测定，记录所有入组大鼠骨密度。②大鼠胸主动脉茜素红染色，取胸主动脉节段，多次使用生理盐水冲洗，剪取0.5 cm置于浓度为10%的甲醛溶液中，浸泡24 h。取出后清水冲洗30 min，进行逐层脱水，并进行透明处理；然后将其置于融化的石蜡中进行包埋，在切片机上将包埋好的组织切片，厚度为4 μm，加热后贴到载玻片上，经60℃烤30 min，进行脱蜡，充分脱蜡后染色；使用茜素红S染色，浓度为2%，染色时间为5 min，对组织进行充分水洗；然后使用盐酸乙醇迅速分化，再次进行流水冲洗，对样本进行脱水、透明处理，使用中性树脂封固后进行显微镜下观察。③血液样本检测：采用酶联免疫吸附试验对大鼠血清样本中BGP、PⅠNP、CTX-Ⅰ水平。④检测大鼠胸主动脉RANKL蛋白及OPG蛋白表达情况，采用Western印迹法进行，配制检测所需溶液，制备检测样本，取大鼠胸主动脉组织，剪碎后加入蛋白裂解液，确定其充分分解后过沸水，然后进行离心处理，分离上层清液用于二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定。经灌胶、蛋白上样、电泳、转膜、封闭、孵育后获得最终蛋白检测结果，并记录各大鼠RANKL蛋白及OPG蛋白表达情况。⑤RT-PCR检测OPG及RANKL mRNA表达。内参基因与目标基因的引物序列：RANKL正义链：5′-CATCGGAAAGCACCCTGGTA-3′，反义链：5′-CACTCAGCCAATTCGGTAT-3′(201 bp)；OPG正义链：5′-CCATCGGGTTCCCATAAAGTCAGT-3′，反义链：5′-AAAGCCCCAA-AGTAGTACGTCGCATCT-3′(407 bp)；β-actin正义链：5′-TGAACGGGAAGCTCACTCG-3′，反义链：5′-CCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(307 bp)。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，DNA条带的单位面积光密度用凝胶成像仪测定，目的基因mRNA含量以与参照物基因的光密度比值表示。

1.4统计学方法 采用SPSS18.0软件行χ2、t检验。

2 结 果

2.1骨密度测量结果分析 在完成造模后16 w测量骨密度发现，造模组大鼠骨密度〔(0.27±0.03)g/cm2〕明显低于空白对照组及假手术组〔(0.33±0.01)g/cm2、(0.32±0.02)g/cm2；P<0.05〕，在干预后发现，骨质疏松组骨密度明显低于空白对照组、假手术组及地诺单抗中剂量、高剂量干预组(P<0.05)，地诺单抗中剂量、高剂量干预组骨密度与空白对照组、假手术组无明显差异(P>0.05)，中剂量组骨密度与高剂量组骨密度无明显差异(P>0.05)，见表1。

2.2血清CTX-Ⅰ、PⅠNP及BGP浓度 骨质疏松组血清PⅠNP、BGP水平明显低于空白对照组、假手术组及地诺单抗中、高剂量组(P<0.05)，骨质疏松组血清CTX-Ⅰ水平明显高于空白对照组、假手术组及地诺单抗中剂量、高剂量干预组(P<0.05)，地诺单抗中剂量组、高剂量组PⅠNP、BGP、CTX-Ⅰ水平与空白对照组、假手术组无明显差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组骨密度及血清CTX-Ⅰ、PⅠNP、BGP浓度和RANKL、OPG蛋白表达及主动脉RANKL mRNA及OPG mRNA表达对比

2.3胸主动脉染色结果分析 钙化物质染色后呈橘红色，假手术组及空白对照组无明显橘红色沉积；骨质疏松组存在明显橘红色沉积；地诺单抗干预组胸主动脉内存在较少量的橘红色钙化沉积，且中剂量组、高剂量组钙化沉积减少更明显，见图1。

2.4主动脉组织RANKL mRNA及OPG mRNA表达 骨质疏松组主动脉组织RANKL mRNA表达明显高于空白对照组、假手术组及地诺单抗中剂量、高剂量干预组，骨质疏松组主动脉组织OPG mRNA表达明显低于空白对照组、假手术组及地诺单抗中剂量、高剂量干预组(P<0.05)，地诺单抗中剂量、高剂量组RANKL mRNA、OPG mRNA表达与空白对照组、假手术组无明显差异(P>0.05)，见表1。

2.5主动脉组织RANKL蛋白及OPG蛋白表达情况分析 骨质疏松组主动脉组织RANKL蛋白表达明显高于空白对照组、假手术组及地诺单抗中剂量、高剂量干预组，骨质疏松组主动脉组织OPG蛋白表达明显低于空白对照组、假手术组及地诺单抗中剂量、高剂量干预组(P<0.05)，地诺单抗中剂量、高剂量组RANKL蛋白、OPG蛋白表达与空白对照组、假手术组无明显差异(P>0.05)，见表1，图2。

1～6:空白对照组，假手术组，骨质疏松组，地诺单抗低剂量组，地诺单抗中剂量组，地诺单抗高剂量组图2 RANKL蛋白及OPG蛋白表达

3 讨 论

骨质疏松及血管钙化属于临床比较常见的老年性疾病，随患者年龄增加其发病率明显增加。骨密度降低是骨质疏松的主要临床表现，增加患者骨折发生率。血管钙化是多种心脑血管疾病的独立危险因素，会增加患者心肌缺血、血管破裂及血栓等疾病的形成，威胁患者生命安全〔6〕。以往研究认为血管钙化的过程不可逆，且并多数认为血管钙化与骨质疏松无明显联系〔7〕。但是随着医学临床的不断拓展，越来越多的学者在研究中指出，骨质疏松患者具有更高的血管钙化发生率〔8〕。

老年性骨质疏松多见于60岁以上的男性患者及70岁以上的女性患者，其发病率受人口结构影响呈现明显升高趋势。本次研究通过切除大鼠双侧睾丸的方式制成老年性骨质疏松模型，结果显示，在切除双侧睾丸后大鼠出现骨吸收增加，骨密度降低情况，证明切除大鼠双侧睾丸可制成老年性骨质疏松模型。并在研究中设置假手术组，有效避免因手术导致的骨密度降低干扰。PⅠNP、BGP、CTX-Ⅰ是反映骨代谢水平的常用指标，随患者年龄增长PⅠNP、BGP水平明显降低，而CTX-Ⅰ水平呈现升高趋势。本次研究对各组大鼠血清PⅠNP、BGP、CTX-Ⅰ水平进行分析，结果证明骨质疏松者骨细胞转换率下降，成骨细胞活性降低，影响血清中骨密度标志物水平。有报道指出，血管病变发生率与骨折风险呈正比例关系〔9〕。也有学者曾开展大样本研究分析得出骨密度降低会增加老年动脉粥样硬化的形成率〔10〕。通过对以往研究进行分析可以发现，血管钙化与老年性骨质疏松之间呈现正相关性。

OPG/RANKL信号通路是目前临床研究骨质疏松的热点，一旦发生OPG/RANKL平衡失衡情况，就会出现骨代谢异常情况，影响患者机体钙磷代谢。OPG被称为破骨细胞抑制因子，由骨髓基质细胞和成骨细胞表达，对于破骨细胞活性可以起到抑制作用，增加骨密度。而RANKL的功能与OPG相反，可促进破骨细胞成熟，增加骨吸收。RANK与OPG会竞争性与RANKL结合，对于破骨细胞成熟及骨吸收起到抑制作用。有报道指出，敲除小鼠OPG基因对于骨质疏松发生可起到诱导作用，而OPG过度表达小鼠会出现骨硬化症情况。本研究结果显示，骨质疏松大鼠存在OPG/RANKL信号通路异常情况，而维持OPG/RANKL信号通路平衡更有利于骨骼维持正常代谢。随着医学临床的不断拓展，已有报道指出，在血管钙化过程中OPG/RANKL信号通路同样发挥着重要的作用，是连接血管系统及骨骼系统的桥梁〔11〕。有报道指出，敲除小鼠OPG基因不仅可导致小鼠出现骨质疏松，对于主动脉血管钙化同样起到促进作用〔12〕。也有研究指出，存在RANKL过度表达的小鼠具有更高的血钙水平，且骨密度明显低于RANKL正常表达小鼠〔13〕。本研究结果证实在骨质疏松中具有更高的血管钙化发生率。分析OPG、RANKL不仅可作为骨骼疾病的诊断指标，在预测心血管疾病中同样均有非常重要的意义。

通过对OPG/RANKL信号通路进行分析，认为对该通路进行干预，在一定程度上可改善骨密度降低情况，对于血管钙化同样可以起到改善和预防作用。本研究对于造模成功的骨质疏松大鼠进行地诺单抗干预，分析其对于大鼠相关指标以及OPG/RANKL信号通路的影响。通过对OPG/RANKL信号通路的作用原理进行分析发现，对其中任意一个环节进行干预，均可起到调节骨代谢平衡的作用。目前临床针对这一信号通路的药物主要包含RANK受体抑制剂、PANKL单克隆抗体等，其中首先应用于临床治疗的药物为RANKL单克隆抗体类药物地诺单抗，该药物具有非常高的亲和力。地诺单抗会特异性结合RANKL，抑制破骨细胞成熟、活化，其作用类似于OPG，起到增加骨密度、降低骨吸收的作用。已有报道指出，地诺单抗可有效降低绝经后女性的骨折发生率，升高患者骨密度〔14〕。也有研究指出，对骨质疏松大鼠给予地诺单抗干预可有效预防糖皮质激素诱导的骨密度降低情况〔15〕。本次研究猜测OPG/RANKL信号通路可能是导致骨密度降低，引发骨质疏松症的发病机制。

本研究对经地诺单抗干预大鼠骨密度及OPG、RANKL蛋白表达情况进行分析，结果显示采用地诺单抗进行治疗很大程度上可调节患者OPG/RANKL信号通路，优化骨形成、骨吸收这一动态平衡，提高老年性骨质疏松大鼠骨密度。本研究对相关骨吸收标志物进行检测，结果显示，地诺单抗对于PⅠNP、BGP、CTX-Ⅰ水平均可起到良好的改善效果。本次研究中经双侧睾丸切除干预大鼠均出现老年性血管钙化，经染色后发现在血管内壁存在大量橘红色沉淀，而采用地诺单抗干预组大鼠血管内橘红色沉淀明显减少，由此可见，采用地诺单抗进行干预可有效缓解血管内钙沉积，对于血管钙化可以起到治疗及预防作用。分析其原因可能是因为地诺单抗可有效升高OPG蛋白表达，抑制RANKL蛋白表达，对于骨质疏松进程起到减缓效果，使骨组织中钙磷沉积增多，而血管中钙磷沉积减少，对于血管钙化及骨质疏松可以同时起到缓解作用，地诺单抗通过影响OPG/RANKL信号通路对机体起到双保护作用。