黄芩苷通过调控miR-145抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭

卓冰冷 彭艳 周志玉

(海口市人民医院健康管理体检部，海南 海口 570208)

卵巢癌是一种常见的女性恶性肿瘤，其发病率和死亡率居女性肿瘤的前列，预后不良，严重影响女性健康〔1〕。卵巢癌早期症状不明显，大部分患者确诊时已是晚期，且发生转移，增加临床的治疗难度，进一步导致卵巢癌患者预后差、死亡率居高不下〔2〕。卵巢癌的治疗方式除常见的手术、放化疗外，基因治疗成为研究的热点〔3,4〕。微小RNA(miRNA)是近年来研究的热点，可作为肿瘤诊断、治疗的潜在基因靶点。miR-145在多肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。研究发现，黄芩苷可通过调控miR-145影响肿瘤细胞的生长、侵袭〔5〕。黄芩是一种常见的中草药，对多种疾病如肺炎、高血压等有治疗作用〔6,7〕。现代药理研究表明，黄芩对肿瘤的病理演进过程发挥抑制作用。黄芩苷是一种天然黄酮，是黄芩的主要活性成分，被研究证实在多种肿瘤细胞增殖过程中发挥抑制作用〔8,9〕，其抗肿瘤作用机制较复杂，尚未完全明确。本研究拟从miR-145的角度探究黄芩苷对卵巢癌细胞增殖、侵袭的调控作用，为黄芩苷抗肿瘤机制的进一步阐释提供理论基础。

1 材料与方法

1.1实验主要材料 卵巢癌多种细胞系(SKOV3、HO-8910、SW626、A2780、Caov-3)购自北纳生物有限公司，黄芩苷购自中国药品生物制品检定所，DMEM培养基、RPMI1640培养基、L15培养基、胎牛血清、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，Lipofectamine2000购自美国Life Technologies公司，Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量聚合酶链反应(qPCR)购自宝生物工程(大连)有限公司；流式细胞检测试剂盒购自美国赛默飞世尔生物科技有限公司，Transwell小室购自美国Corning公司，miR-145抑制剂购自上海吉凯生物有限公司。酶标仪购自德国Binder公司，流式细胞仪、7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2细胞的培养 Caov-3、A2780细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基，SKOV3、HO-8910细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，SW626细胞培养于含10%胎牛血清的L15培养基，均置于5%CO2、37℃培养箱孵育。

1.3细胞的转染 选取对数期Caov-3细胞，随机分为对照组、黄芩苷(100 μmol/L)组、anti-miR-145组、黄芩苷+anti-miR-145组。在Lipofectamine2000说明书指示下，anti-miR-145组Caov-3细胞中转染miR-145抑制剂；黄芩苷+anti-miR-145组细胞中转染miR-145抑制剂后加入100 μmol/L黄芩苷进行处理，置于5%CO2、37℃培养箱培养，对照组为常规培养的Caov-3细胞。

1.4qPCR实验 黄芩苷粉与适量DMSO溶液充分混合，浓度调整为5 000 μmol/L，暗室中保存，实验前，加入细胞培养液稀释为1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L，分别加入各组细胞中，在Trizol试剂说明书指示下，提取各组卵巢癌细胞总RNA，加入1.0 μl逆转录酶，37℃孵育15 min，95℃孵育5 s，合成cDNA。以β-actin为参照，进行qPCR，根据qPCR实际说明书指示，扩增条件为95℃ 3 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环，结果采用2-ΔΔCt法进行计算。miR-145和β-actin引物由上海生工合成，miR-145正义链：5′-TTGTCCTCACGGTCCAGTTT-3′，反义链：5′-TTTCCA GGAATCCCCATCTTAGC-3′；β-actin正义链：5′-GC ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′，反义链：5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTTTT-3′。

1.5MTT实验 收集对照组、黄芩苷(100 μmol/L)组、anti-miR-145组、黄芩苷+anti-miR-145组Caov-3细胞，将3×103个Caov-3细胞接种至96孔板，37℃培养24、48、72 h，每孔Caov-3细胞中加入20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃培养4 h，每孔Caov-3细胞中加入150 μl DMSO，37℃培养10 min，振荡15 min，置于酶标仪检测570 nm吸光值(A值)。

1.6流式细胞术实验 将对照组、黄芩苷(100 μmol/L)组、anti-miR-145组、黄芩苷+anti-miR-145组Caov-3细胞浓度调整为1×106/ml，37℃培养24 h，每组设置5个复孔，吸取10 μl 磷脂酰结合蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)和5 μl碘化丙啶(PI)加入每孔Caov-3细胞，暗室中染色15 min，置于流式细胞仪中检测凋亡率。

1.7Transwell实验 收集对照组、黄芩苷(100 μmol/L)组、anti-miR-145组、黄芩苷+anti-miR-145组转染24 h的Caov-3细胞，加入无血清培养基重悬，基质胶与DMEM培养基按1∶5进行稀释，加入Transwell小室膜中，进行细胞侵袭实验；Transwell上室加入2×105个Caov-3细胞重悬液，Transwell下室加入600 μl含10%胎牛血清培养基，37℃培养24 h；磷酸盐缓冲液(PBS)清洗、棉签轻轻擦拭Transwell上室，甲醛固定30min，结晶紫染色30min，显微镜下拍照、计数5个区域细胞，取其平均值。细胞迁移实验Transwell小室不添加基质胶稀释液，其与同侵袭。

1.8统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1黄芩苷对卵巢癌多种细胞系中miR-145表达量的影响 与人正常卵巢上皮细胞(IOSE80，1.000±0.085)相比，100 μmol/L黄芩苷作用于卵巢癌多种细胞系(SKOV3、HO-8910、SW626、A2780、Caov-3)明显促进miR-145的表达量(1.653±0.112，1.896±0.105，2.315±0.164，3.251±0.232，3.852±0.241，P<0.05)，其中在Caov-3细胞中的表达量相对较高。

2.2不同浓度黄芩苷对miR-145表达量的影响 与对照组(1.000±0.073)相比，1、5、25、50、100 μmol/L黄芩苷组miR-145相对表达量(1.265±0.087、1.315±0.109、2.152±0.185、3.025±0.231、3.865±0.263)均显著升高，且呈浓度依赖性(P<0.05)；因此选取100 μmol/L黄芩苷作为后续实验对象。

2.3黄芩苷联合miR-145抑制剂对miR-145表达量的影响 与对照组比较，100 μmol/L黄芩苷组miR-145相对表达量显著升高(P<0.05)；与100 μmol/L黄芩苷组比较，anti-miR-145组miR-145相对表达量显著降低(P<0.05)；与anti-miR-145组比较，黄芩苷+anti-miR-145组miR-145相对表达量显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 黄芩苷联合miR-145抑制剂对miR-145表达量、细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移

2.4黄芩苷联合miR-145抑制剂对细胞增殖的影响 与对照组比较，100 μmol/L黄芩苷组48、72 h细胞增殖显著降低(P<0.05)；与100 μmol/L黄芩苷组比较，anti-miR-145组48、72 h细胞增殖显著升高(P<0.05)；与anti-miR-145组比较，黄芩苷+anti-miR-145组48、72 h细胞增殖显著降低(P<0.05)。见表1。

2.5黄芩苷联合miR-145抑制剂对细胞凋亡的影响 与对照组比较，100 μmol/L黄芩苷组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与100 μmol/L黄芩苷组比较，anti-miR-145组细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；与anti-miR-145组比较，黄芩苷+anti-miR-145组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表1，图1。

图1 黄芩苷联合miR-145抑制剂对细胞凋亡的影响

2.6黄芩苷联合miR-145抑制剂对细胞侵袭、迁移的影响 与对照组比较，100 μmol/L黄芩苷组细胞迁移和侵袭细胞数显著降低(P<0.05)；与100 μmol/L黄芩苷组比较，anti-miR-145组细胞迁移和侵袭细胞数显著升高(P<0.05)；与anti-miR-145组比较，黄芩苷+anti-miR-145组细胞迁移和侵袭细胞数显著降低(P<0.05)。见表1，图2。

图2 黄芩苷联合miR-145抑制剂对细胞迁移、侵袭的影响(结晶紫染色，×200)

3 讨 论

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，也是女性肿瘤死亡率居高不下的主要原因。卵巢癌患者预后差，目前无有效治疗方案。miRNA被证实参与多种肿瘤的发生发展，并与肿瘤患者的临床病理特征显著相关，可作为肿瘤基因靶向诊断、治疗的潜在分子靶点〔10～13〕。miR-145被证实在多肿瘤生长、转移过程中发挥重要作用。在非小细胞肺癌中，miR-145表达量降低，过表达miR-145抑制细胞的迁移和侵袭〔14〕。miR-145在膀胱癌组织及多种细胞系中表达量降低，过表达miR-145可抑制细胞的增殖及促进细胞凋亡，表明miR-145有抗肿瘤作用〔15〕。在卵巢癌组织生长过程中，miR-145表达量明显降低，过表达miR-145显著抑制细胞增殖，诱导其凋亡〔16〕，表明miR-145在卵巢癌病理进程中发挥重要的作用。

黄芩苷是中药黄芩的重要活性成分，被证实有多种病理作用如抗感染〔17〕、抗病毒〔18〕等。研究发现，黄芩苷可通过调控miRNA的表达量从而影响肿瘤细胞的增殖、侵袭等过程。黄芩苷作用的前列腺癌细胞中miR-485-5p表达量显著增加，表明黄芩苷可能通过促进miR-485-5p表达量抑制前列腺癌细胞增殖〔19〕。与正常乳腺细胞相比，miR-126在乳腺癌细胞中表达量明显降低，进一步检测黄芩苷作用的乳腺癌细胞中miR-126表达量明显上调，提示黄芩苷可能通过上调miR-126抑制乳腺癌细胞的增殖、促进凋亡〔20〕。上述研究表明，黄芩苷可能通过调控肿瘤细胞中的miRNA表达量发挥抗肿瘤作用。本研究结果表明miR-145在卵巢癌病理演进过程中发挥抗癌作用，与刘龙浩等〔16〕报道结果相一致；100 μmol/L黄芩苷可抑制Caov-3细胞的增殖、侵袭、迁移，促进凋亡，进一步证实黄芩苷在卵巢癌发生发展过程中发挥抗癌作用；黄芩苷作用于转染miR-145抑制剂的Caov-3细胞中发现，miR-145抑制剂与黄芩苷联合作用明显逆转黄芩苷对Caov-3细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用及凋亡促进作用，表明在卵巢癌发生发展中，黄芩苷通过上调miR-145抑制细胞的恶性生物学特性。

综上，黄芩苷可上调卵巢癌细胞中miR-145的表达量，有一定浓度依赖性；黄芩苷抑制Caov-3细胞增殖、迁移、侵袭，促进凋亡，其作用机制是通过上调miR-145的表达量。本实验仅在细胞水平进行了初步研究，未来会通过构建动物模型、探究miR-145下游靶基因等多方面进一步研究黄芩苷的作用机制。