HPLC法同时测定四季抗病毒合剂中17种成分的含量

2022-10-27 05:51王丽丽雷美娜王四旺肖会敏
西北药学杂志 2022年6期
关键词:奎宁紫苏连翘

王丽丽,赵 荣,何 悦,许 璐,雷美娜,彭 真,王四旺,肖会敏*

1.西安航天总医院,西安 710199;2.陕西海天制药有限公司,咸阳 712000;3.陕西含光生物科技有限公司,西安 710032;4.西北大学生命科学与医学部,西安 710069

手足口病是由肠道病毒引起的传染病,多发生于5岁以下儿童,表现为口痛、厌食、低热,以及手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡,多数患儿1周左右自愈,少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症,目前尚无特效药。四季抗病毒合剂对手足口病与呼吸道感染具有较好的疗效[1-10]。四季抗病毒合剂(国药准字Z20027669)由鱼腥草、桔梗、桑叶、连翘、荆芥、薄荷、紫苏叶、苦杏仁、芦根、菊花、甘草11味中药组成,具有清热解毒、消炎退热的功能,用于治疗上呼吸道感染、病毒性感冒、流感、腮腺炎等病毒性感染性疾病。经检索文献,四季抗病毒合剂有含量测定研究[11-14]及抗手足口病基础研究[15-17];四季抗病毒合剂中含有新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、连翘酯苷B、连翘酯苷A、异槲皮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、迷迭香酸、连翘苷、蒙花苷、槲皮素、甘草酸、紫苏醛等成分[18-27],但发现未有同时测定新绿原酸、绿原酸、咖啡酸等17种成分的研究报道。因此,本研究用高效液相色谱(HPLC)法同时测定制剂中新绿原酸、绿原酸、咖啡酸等17种成分的含量,为控制本品质量、表征制剂中的主要活性成分提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Prominence UFLC高效液相色谱仪(日本岛津公司);Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,瑞典AKZO NOBEL公司);BSA124S型电子分析天平(赛多利斯公司);KQ-5200DE台式数控超声波清洗器(上海虔钧科学仪器有限公司)。

1.2 试药

四季抗病毒合剂(批号170201~170210),鱼腥草,桔梗,桑叶,连翘,荆芥,薄荷,紫苏叶,苦杏仁,芦根,菊花,甘草(由陕西海天制药有限公司提供)。对照品:新绿原酸(批号MUST-10091501,质量分数≥98%),购自成都曼思特生物科技有限公司;绿原酸(批号110753-201716,质量分数≥99.3%)、咖啡酸(批号110885-201703,质量分数≥99.7%)、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸(批号111717-201402,质量分数≥94.5%)、连翘酯苷B(批号111811-201603,质量分数≥96.6%)、连翘酯苷A(批号111810-201606,质量分数≥93.4%)、异槲皮苷(批号111809-201403,质量分数≥92.9%)、甘草苷(批号111610- 201607,质量分数≥93.1%)、阿魏酸(批号110773-201614,质量分数≥99%)、橙皮苷(批号110721-201617,质量分数≥96.1%)、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸(批号111782-201405,质量分数≥98%)、迷迭香酸(批号111871-201706,质量分数≥90.5%)、连翘苷(批号110821-201615,质量分数≥94.9%)、蒙花苷(批号111528-201710,质量分数≥96.6%)、槲皮素(批号100081-201610,质量分数≥99.8%)、甘草酸(批号110731-201619,质量分数≥93%)、紫苏醛(批号111806-201605,质量分数≥94.4%),均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯(美国Honeywell公司)。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);以乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱程序见表1;检测波长为277、254 nm;记录时间为75 min;流速为0.8 mL·min-1;柱温为30 ℃;进样量为5 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液 分别精密称取新绿原酸6.90 mg、绿原酸4.80 mg、咖啡酸10.00 mg、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸11.00 mg、连翘酯苷B 16.60 mg、连翘酯苷A 18.00 mg、异槲皮苷22.00 mg、甘草苷6.40 mg、阿魏酸6.90 mg、橙皮苷8.00 mg、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸9.80 mg、迷迭香酸4.40 mg、连翘苷6.10 mg、蒙花苷4.10 mg、槲皮素11.20 mg、甘草酸6.50 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇适量,再精密称取紫苏醛10.6 mg加入量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得17种混合对照品溶液,其质量浓度分别为676.20、476.64、997.00、1 039.50、1 603.56、1 681.20、2 043.80、595.84、683.10、768.80、960.40、398.20、578.89、396.06、1 117.76、604.50、1 000.64 μg·mL-1,作为储备液。

2.2.2供试品溶液 取四季抗病毒合剂,精密量取1.0 mL,置于5 mL量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,用0.22 μm滤膜滤过,取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液 根据四季抗病毒合剂处方,分别制备缺连翘(即连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷阴性对照品),缺甘草(即甘草苷与甘草酸阴性对照品),缺紫苏叶(即紫苏醛阴性对照品)、缺菊花、鱼腥草(即1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、新绿原酸、绿原酸、异槲皮苷的阴性对照品),缺菊花、薄荷(即橙皮苷、蒙花苷阴性对照品),缺紫苏叶、荆芥和芦根(即咖啡酸、迷迭香酸、阿魏酸阴性对照品),缺菊花、桑叶和鱼腥草(即槲皮素阴性对照品)的模拟制剂,再根据2.2.2项分别制备相应的阴性对照溶液。

3 结果

3.1 线性关系

吸取2.2.1项储备液12.5、62.5、312.5、625.0、1 250.0、2 500.0 μL,分别置于5 mL量瓶中,分别加甲醇至刻度,即得由新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、连翘酯苷B、连翘酯苷A、异槲皮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、迷迭香酸、连翘苷、蒙花苷、槲皮素、甘草酸、紫苏醛17种成分组成的系列质量浓度的混合对照品溶液,即1、2、3、4、5、6,分别用0.45μm微孔滤膜滤过,进样测得峰面积。以各对照品的质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(x)、峰面积值为纵坐标(y),进行线性回归,绘制标准曲线。得线性方程、线性范围及相关系数(r),见表2。结果表明,17种对照品在相应质量浓度范围内线性关系良好。

表2 线性关系测定结果

3.2 专属性实验

分别精密量取混合对照溶液、供试品溶液、各种阴性对照溶液各5 μL进样,记录色谱图。结果,阴性对照品无干扰,各峰分离度良好,见图1,表明该方法专属性强。

注:A.混合对照品(277 nm);B.混合对照品(254 nm);C.四季抗病毒合剂(277 nm);D.四季抗病毒合剂(254 nm);E.缺连翘对照品(即连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷阴性对照品,277 nm);F.缺甘草对照品(即甘草苷与甘草酸阴性对照品,277 nm);G.缺紫苏叶对照品(即紫苏醛阴性对照品,254 nm); H.缺菊花、鱼腥草对照品(即1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、新绿原酸、绿原酸、异槲皮苷的阴性对照品,277 nm);I.缺菊花、薄荷对照品(即橙皮苷、蒙花苷阴性对照品,277 nm);J. 缺紫苏叶、荆芥和芦根对照品(即咖啡酸、迷迭香酸、阿魏酸阴性对照品,277 nm);K.缺菊花、桑叶和鱼腥草对照品(即槲皮素阴性对照品,277 nm);1.新绿原酸;2.绿原酸;3.咖啡酸;4. 1,3-O-二咖啡酰奎宁酸;5.连翘酯苷B;6.连翘酯苷A;7.异槲皮苷;8.甘草苷;9.阿魏酸;10.橙皮苷;11. 3,5-O-二咖啡酰奎宁酸;12.迷迭香酸;13.连翘苷;14.蒙花苷;15.槲皮素;16.甘草酸;17.紫苏醛。

3.3 精密度实验

取混合对照品溶液6,按照2.1项下色谱条件连续进样6次,测得新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、连翘酯苷B、连翘酯苷A、异槲皮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、迷迭香酸、连翘苷、蒙花苷、槲皮素、甘草酸、紫苏醛的峰面积的RSD值分别为1.87%、1.51%、1.32%、1.67%、1.49%、0.52%、1.57%、1.86%、0.90%、0.76%、1.32%、1.29%、0.18%、0.16%、0.62%、0.72%、0.18%,表明该方法精密度良好。

3.4 稳定性实验

取混合对照品溶液6,分别在第0、2、4、6、8、12、24 h进样。结果新绿原酸、绿原酸、咖啡酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、连翘酯苷B、连翘酯苷A、异槲皮苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、迷迭香酸、连翘苷、蒙花苷、槲皮素、甘草酸、紫苏醛的峰面积的RSD值分别为0.18%、0.57%、0.60%、0.43%、0.19%、0.11%、0.21%、0.30%、0.26%、0.17%、1.11%、1.20%、0.30%、0.33%、0.14%、0.49%、1.25%,表明该溶液在24 h内稳定。

3.5 重复性实验

精密称取6份样品(批号170202),分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件进样测定。结果,各成分含量的RSD值均小于2%,见表3,表明该方法重复性好。

表3 重复性实验结果

3.6 加样回收实验

精密量取四季抗病毒合剂(批号170202)0.50 mL,按要求添加对照品,按照2.2.2项下方法制备供试品溶液,共制备6份样品,按照2.1项下色谱条件进样并测定峰面积,计算各成分的平均回收率(%)及RSD(%)。结果各成分平均回收率均大于96%,RSD值均小于2%。

3.7 含量测定

精密量取10批四季抗病毒合剂样品,分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液,按2.1项下色谱条件进样测定。10批样品中各成分含量的RSD值均小于2%,见表4,说明批次间各成分含量变化较小。

表4 四季抗病毒合剂中17种成分含量测定结果

4 讨论

4.1 检测波长的选定

用二极管阵列检测器对本试验所测定的17种成分进行全波长分析,最大吸收波长不一,新绿原酸(325 nm)、绿原酸(326 nm)、咖啡酸(322 nm)、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸(321 nm)、连翘酯苷B(330 nm)、连翘酯苷A(329 nm)、异槲皮苷(255、354 nm)、甘草苷(276 nm)、阿魏酸(322 nm)、橙皮苷(283 nm)、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸(327 nm)、迷迭香酸(329 nm)、连翘苷(228、278 nm)、蒙花苷(268、334 nm)、槲皮素(255、371 nm)、甘草酸(250 nm)、紫苏醛(232 nm)。经过筛选200、254、277、320、348 nm波长,考察各波长的色谱信息,经比较发现,除紫苏醛以外的其他16种成分在277 nm处各峰分离度好,基线平稳,且峰形较好;紫苏醛在波长254 nm处检出峰形较好,且其他峰也可显示。因此选择254 nm作为紫苏醛检测波长,其余16种成分选用277 nm。

4.2 其他色谱条件的选定

比较不同柱温(30℃、35℃)、制样采用不同稀释倍数(未稀释、稀释5倍、稀释10倍),不同进样量(5、10 μL)时的色谱图。结果发现柱温为30 ℃、稀释倍数为5倍和进样量为5 μL时各峰分离度较好,特征性强,峰形较好,故确定柱温为30 ℃、制样稀释倍数为5倍和进样量为5 μL。流动相考察: 通过考察1 mL·L-1甲酸-甲醇、1 mL·L-1磷酸-甲醇、1 mL·L-1甲酸-乙腈、1 mL·L-1磷酸-乙腈等流动相体系,比较各流动相组成条件下色谱图中各组分基线状况、峰形、分离度等,结果表明,用乙腈-1 mL·L-1磷酸为流动相进行梯度洗脱时,基线平稳、色谱峰峰形良好、分离度高、谱图信息较为丰富。

4.3 专属性实验

据文献报道,新绿原酸、绿原酸、异槲皮苷主要来源于处方中的鱼腥草和菊花[18,20];咖啡酸、迷迭香酸主要来源于紫苏叶、荆芥和芦根[23,26-27];紫苏醛主要来源于紫苏叶[23];1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸来源于菊花[18];连翘酯苷B、连翘酯苷A、连翘苷来源于连翘[19];甘草苷、甘草酸来源于甘草[21];阿魏酸主要来源于芦根和紫苏叶[23,27];橙皮苷、蒙花苷主要来源于薄荷和菊花[18,24];槲皮素来自于菊花、桑叶和鱼腥草[18,20,22]。将各成分制备成相应的模拟制剂,依据供试品制备方法制成阴性对照溶液。结果显示,各个阴性对照均无干扰,说明专属性强。

总之,本实验通过高效液相色谱法对四季抗病毒合剂中17种成分进行了定量研究,制样方法简便,具有良好的重复性与稳定性,可用于评价四季抗病毒合剂的质量,也为四季抗病毒合剂临床应用提供了依据,为以后的药代动力学研究奠定了基础。

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