桑白皮总黄酮抑制分泌性中耳炎大鼠耳黏膜的自噬作用

苏吉利，曲丹菊，周 倩，王广科

1.河南科技大学临床医学院/河南科技大学第一附属医院耳鼻咽喉科，洛阳 471003；2.河南省人民医院耳鼻喉科，郑州 450003

分泌性中耳炎(otitis media with effusion，OME)是一种中耳非化脓性炎性疾病，常发生于儿童，其主要的病理特征是中耳积液和听力下降[1]。桑白皮总黄酮对高脂血症合并高尿酸血症大鼠有肾脏保护作用[2]。临床研究表明，慢性阻塞性肺病急性加重期用桑白皮可降低患者血清炎症标志物[3]。自噬是细胞发生的一种程序性死亡方式，正常情况下，自噬可调节巨噬细胞向M2型分化，发挥抗炎作用，但是当机体发生感染或受到外界刺激时，过度的自噬会造成巨噬细胞应激性死亡，失去向M2型巨噬细胞分化的功能，加重炎症反应[4]。罗永锋等[5]研究发现，缺氧激活视网膜色素上皮细胞自噬水平，从而促进细胞分泌炎症因子。UMEYAMA L等[6]研究发现，桑白皮通过激活Toll样受体抑制咪喹莫特诱导的小鼠耳组织炎症反应及耳水肿。本研究通过建立OME大鼠模型，用桑白皮总黄酮灌胃治疗探讨桑白皮对OME的改善状况及抑炎作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器

多功能酶标仪购自美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 试药

桑白皮总黄酮提取：桑白皮粉末200 g，加乙醚500 mL，搅拌混匀后，浸泡4 h，收集浸液，滤渣中重新加入乙醚500 mL，重复操作2次，回收乙醚。再在滤渣中加入体积分数为50%的乙醇600 mL，50 ℃超声萃取30 min，过滤，再次加入体积分数为50%的乙醇600 mL超声萃取，过滤，重复操作2次，收集所有滤液，95 ℃水浴蒸干，得桑白皮总黄酮，存储于冰箱中待用。实验时桑白皮总黄酮中加入数滴吐温-80，用生理盐水调整至实验所需质量浓度。

卵清蛋白购自北京国药集团化学试剂有限公司；TUNEL试剂盒购自上海罗氏制药有限公司；HE染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)以及肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)ELISA试剂盒均购自美国ABclonal公司；Beclin1、p62、LC3 Ⅱ和LC3 Ⅰ抗体均购自美国Abcam公司；HRP标记的二抗购自武汉博士德生物公司。

1.3 实验动物

健康清洁级雄性SD大鼠40只，8 周龄，体质量为180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2018-0001。

2 方法

2.1 造模与分组

OME大鼠模型制备[7]：第1天，按照随机数字表法选取30只大鼠，腹腔注射卵清蛋白0.3 mg与氢氧化铝溶液(1.28 g氢氧化铝溶于PBS 0.15 mL)，以达全身致敏阶段；第7天，用相同的方式和剂量再进行腹腔注射。第14天，戊巴比妥钠腹腔麻醉，手术显微镜辅助下，微量进样器经鼓膜将卵清蛋白0.1 mg溶于 PBS 35 μL中注入大鼠中耳腔。第15天，腹腔再次麻醉，耳内镜观察鼓膜情况，并进行卵清蛋白第二次注射，此阶段为耳内激发阶段，48 h后，电耳镜观察大鼠鼓膜情况，以鼓膜出现凹陷、红斑、可见液平面及气泡形成则为造模成功。

将造模成功的26只大鼠随机分为模型组和治疗组，每组13只，另取10只作为正常组。模型制备成功后第2天起，治疗组大鼠灌胃桑白皮总黄酮25 mg·kg-1，正常组和模型组大鼠灌胃等剂量生理盐水，1 日1次，连续给药2周。

2.2 检测血清中TNF-α、IL-6和IL-1β表达

末次给药结束后，主动脉采血，室温静置30 min，以3 000 r·min-1离心10 min，离心半径8 cm，收集上清液为待测样品。根据说明书将对照品稀释至所需质量浓度，酶标板设置空白孔、标准孔和待测样品孔，每个标准孔中加入50 μL对照品。待测样品孔中首先加入样品稀释液40 μL，再加待测样品10 μL，空白孔加入50 μL PBS，封板后37 ℃孵育30 min，每孔加入100 μL洗涤液洗涤30 s，重复5次，拍干板子。除空白孔外，其余孔加入酶标试剂50 μL，封板后37 ℃孵育30 min，洗涤5次，拍干板子，先加入显色剂A液50 μL，再加入显色剂B液50 μL，振荡混匀，37 ℃避光显色10 min，加入50 μL终止液，在酶标仪上于450 nm波长处测定吸光度(A值)。

2.3 HE染色观察中耳组织病理学变化

采血结束后，颈椎脱臼法处死大鼠，并迅速分离中耳组织，剪取一部分中耳组织置于100 g·L-1多聚甲醛中固定，经常规脱水、包埋、切成片厚4 μm的组织切片，60 ℃烘片2 h，脱蜡至水，进行HE染色。伊红染液染色5 min，蒸馏水冲洗，分化液分化10 min，苏木素染液染色3 min，蒸馏水冲洗，脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

2.4 TUNEL染色检测细胞凋亡

取石蜡切片，常规脱蜡至水，PBS浸洗切片5 min，3次；组织上滴加蛋白酶K工作液100 μL，37 ℃摇床中反应30 min，PBS清洗5 min，3次；每个组织上滴加TdT酶反应液50 μL，37 ℃反应60 min，PBS清洗5 min，3次；滴加TUNEL反应混合液50 μL，37 ℃避光反应1 h，PBS清洗5 min，3次；避光条件下滴加DAPI染液，室温反应10 min，PBS清洗5 min，3次；滴加荧光封片液，荧光显微镜下观察并拍照。

2.5 蛋白印迹法检测自噬相关蛋白表达量

取部分中耳组织，液氮中研磨，RIPA裂解液裂解30 min，在4 ℃ 以12 000 r·min-1离心10 min，离心半径为10 cm，吸取上清液至EP管，BCA试剂盒测蛋白质量浓度，加入5×蛋白上样缓冲液和RIPA裂解液调整蛋白质量浓度，100 ℃煮沸10 min，使蛋白变性稳定。浓缩胶的每孔中加入蛋白样品20 μL，80 V电泳30 min使蛋白运动至分离胶，120 V电泳1.5 h至分离胶底部，0.3 A湿转2 h，TBST洗膜5 min，3次；室温封闭1 h，Beclin1、LC3 Ⅰ、LC3 Ⅱ和p62、GAPDH蛋白一抗(1∶1 000)4 ℃过夜，TBST洗膜5 min，3次；二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，TBST洗膜5 min，3次；ECL法发光显影，Image J软件分析蛋白条带灰度值，目的蛋白条带灰度值/GAPDH灰度值为目的蛋白相对表达量。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 ELISA检测结果

TNF-α、IL-6和IL-1β含量组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较，模型组TNF-α、IL-6和IL-1β含量升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组TNF-α、IL-6和IL-1β含量降低(P<0.05)。见表1。

表1 血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量比较

3.2 HE染色结果

与对照组比较，模型组大鼠耳黏膜细胞肿胀、黏膜厚度增加、炎症细胞浸润、可见多处细胞脱落；与模型组比较，治疗组耳黏膜细胞肿胀情况好转，少量黏膜细胞脱落，炎症细胞浸润减少。见图1。

3.3 TUNEL染色结果

细胞凋亡率组间比较，差异有统计学意义(P<0.01)。与正常组比较，模型组细胞凋亡率升高(P<0.05)；与模型组比较，治疗组细胞凋亡率降低(P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组细胞凋亡率比较

注：A.正常组；B.模型组；C.治疗组。

3.4 蛋白印迹法检测结果

Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义(P<0.01)。与正常组比较，模型组Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相对表达量升高、p62蛋白相对表达量降低(P<0.05)；与模型组比较，治疗组Beclin1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相对表达量降低、p62蛋白相对表达量升高(P<0.05)。见表3、图3。

表3 中耳组织Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62蛋白相对表达量比较

注：A.正常组；B.模型组；C.治疗组。

4 讨论

OME受咽鼓管阻塞和功能障碍、局部感染、免疫功能异常等因素的影响，据统计，国内14岁以下儿童OME的发病率约为70%，且发病率呈逐年上升趋势[8]。部分患者具有自愈倾向，但是大多数患者呈复发性病情，延误治疗容易引起听力损失、中耳粘连、鼓室硬化及鼓室萎缩等并发症[9]。

桑白皮其味甘、性寒、归肺经，临床上常用于治疗呼吸系统疾病、泌尿系统感染或糖尿病。桑白皮的主要活性成分是黄酮类，近年由于桑白皮广泛的药理学活性而受到国内外学者对桑白皮的研究。YU JS，LEYVA-JIMÉNEZ FJ等[10-11]研究发现，桑白皮对脂多糖处理的巨噬细胞及高脂高糖饲养的小鼠均具有抗炎和抗氧化作用。PARK S等[12]研究报道，桑白根皮水浸提液可减轻骨关节炎大鼠的炎症反应，缓解大鼠的病理症状。周宁等[13]研究发现，桑白皮可改善肾源性水肿大鼠肾功能。由以上研究可推测，桑白皮具有良好的抗炎作用。IL-6、IL-β和TNF-α是常见的炎症因子，脑缺血大鼠脑组织炎症反应增强，表现为IL-6、IL-β和TNF-α表达升高[14]。研究发现，愈疡胶囊可抑制肺炎链球菌诱导的中耳炎大鼠炎症反应，降低IL-6、IL-β和TNF-α表达水平[15]。因此，本实验通过建立OME大鼠，灌胃桑白皮进行治疗，结果显示，OME大鼠耳黏膜细胞肿胀、黏膜厚度增加、炎症细胞浸润，并可见多处细胞脱落；OME大鼠血清中炎症因子IL-6、IL-β和TNF-α表达升高，TUNEL染色结果表明，OME大鼠耳黏膜细胞凋亡率升高。桑白皮治疗后大鼠耳黏膜细胞肿胀情况好转，少量黏膜细胞脱落，炎症细胞浸润减少，血清炎症因子表达降低，细胞凋亡率降低。结果表明，桑白皮总黄酮可改善OME大鼠耳黏膜水肿，并抑制细胞凋亡和炎症反应。

自噬是一种依赖于溶酶体的生物降解过程，在维持细胞稳态和适应各种应激状态中具有重要作用。细胞自噬包括3个过程，首先细胞质成分(细胞器、蛋白等)被双层膜囊泡包裹形成自噬泡，自噬泡之间边缘融合形成自噬体，自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体，将吞噬掉的异常蛋白、损伤的细胞器等进行酶消化[16]。既往研究表明，自噬与炎症反应之间存在调节关系，陆梦茹等[17]研究发现，TLR4小干扰RNA可抑制TLR4诱导的小胶质细胞自噬，减轻自噬引起的脑出血后炎症损伤。易凯等[18]研究报道，肾小管上皮细胞在高钙离子环境中自噬被激活，抑制自噬可降低炎症因子的分泌。Beclin-1参与前期自噬泡的形成，是自噬启动阶段重要的修饰物，LC3含量与自噬泡形成数量成正比，贯穿自噬体形成过程，p62是一种多功能基因，在细胞自噬过程中p62被不断消耗，因此LC3、Beclin-1和p62被广泛用于检测细胞自噬[19-20]。本实验中，OME大鼠中耳组织中Beclin1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白相对表达量增多，p62蛋白相对表达量降低，桑白皮治疗后Beclin1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白相对表达量降低，p62蛋白相对表达量升高。实验结果表明，OME大鼠中耳组织上皮细胞自噬水平升高，桑白皮总黄酮可抑制细胞自噬水平。

综上所述，桑白皮总黄酮可改善OME大鼠中耳组织水肿并减轻炎症反应，其可能是通过抑制细胞自噬发生调控作用，为临床治疗OME提供理论依据。