枸杞多酚氧化酶研究进展

张 琪，刘军红

(宁夏大学新华学院，宁夏银川 750000)

枸杞(L.)是传统的中药和保健食品，富含类胡萝卜素、氨基酸、V、多酚、多糖、矿物质等有效成分，具有滋养肝肾、降血糖、降低癌症和延缓细胞衰老、提高免疫力等药理功效。枸杞在采摘、贮藏过程中很容易发生褐变。鲜果枸杞果皮较薄，果实汁液较多，采摘、贮存、运输过程中都极易造成机械损伤，这为枸杞酶促褐变和微生物的侵入创造了有利条件，采后如不及时采取保鲜措施，很快就会发生酶促褐变。目前，枸杞主要以干制、酒类、饮料等产品形式出售，但在干制、榨汁过程中极易造成多糖、维生素、氨基酸等营养成分的损失，在一定程度上降低了枸杞的功效，且干果枸杞在加工及贮藏过程中也会发生褐变，影响品质。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是催化酚类底物氧化的一组金属蛋白酶，广泛存在于多种植物中。PPO是引起枸杞酶促褐变的主要酶类，能够催化底物生成褐色的醌类物质，参与果蔬的酶促褐变反应过程。枸杞贮藏过程鲜果保质期短、干果营养损失大的问题是目前枸杞资源开发利用的瓶颈，如何抑制PPO酶促褐变是解决枸杞鲜果贮藏的关键点。目前所采用的方法主要有物理法、化学抑制剂法、生物源保鲜法等，该研究简要梳理近年报道的枸杞多酚氧化酶相关研究，以期为枸杞酶促褐变基础研究与应用研究提供参考依据。

1 PPO的存在形式及褐变机理

在大多数果蔬中，PPO主要以结合态存在，且多少随果蔬的成熟度的变化而改变。PPO是严格的质体酶，主要分布在完整细胞的有色体、叶绿体和白色体等质体中，底物分布在液泡中，正常情况下两者分离，当果蔬细胞膜结构完整性遭到破坏，分属不同组织区域的PPO与酚类接触，在氧气的作用下催化酚类产生醌，醌自发聚合并与蛋白质的氨基酸残基侧链基团反应产生黑色或褐色物质，从而发生酶促褐变。枸杞果中含有咖啡酸丁二酯、二咖啡酰奎宁酸、绿原酸等12中酚类物质，其中绿原酸的含量最高。绿原酸是枸杞酶促褐变的主要底物之一，是导致枸杞酶促褐变的主要原因。

2 PPO的分子结构

PPO的分子质量范围31～144 kD，且不同成熟期分子质量不同。目前已知的PPO是四聚体蛋白酶，这种四聚体结构依赖于所处的环境，当环境发生改变，这种四聚体会发生解离，因此，植物中的PPO通常以不同的分子形式存在。PPO是核编码的氧化还原酶，其活性中心含有以Cu—Cu离子对形式紧密结合在一起的2个铜离子。围绕2个铜离子形成了由3个组氨酸和1个半胱氨酸形成的CuA区域和由3或4个组氨酸形成的CuB区域，铜离子和硫通过共价键形成特殊的二硫铜复合物。PPO是在胞质中合成的，在运往质体前还包含一个富含His的8～12 kD的信号肽。

3 不同抑制方法对枸杞中PPO活性的影响

物理法主要是通过温度、pH、气体成分、压力等物理参数的改变延缓酶促褐变的发生。

温度。温度对PPO的活性有较大影响，高温和低温对PPO的活性都有抑制作用，其影响程度因果蔬的品种、部位而有所不同。枸杞PPO的最适温度为36 ℃左右，不同品种的枸杞最适温度略有差异。

研究证实，低温能显著抑制PPO的活性，缓解酶促褐变的发生。葛向珍等研究对比了低温和常温对去梗大果枸杞保鲜的影响，结果表明，低温贮藏可以有效维持果实品质。低温贮藏的温度控制在0 ℃与生物冰点温度之间能更好地减少果实内部水分的损失、降低酶活性，进而保证果实的理化指标、减少营养物质的损失、延长枸杞的贮存期。低温贮存条件下除了抑制PPO的活性，果实也能维持较高的活性氧清除能力、较好地保持细胞膜的完整性，从而抑制枸杞果实褐变的发生。同时低温也会影响非酶促褐变的发生，抑制微生物的大量繁殖，抑制枸杞呼吸强度、果胶酶活性，减缓可滴定酸含量、过氧化物酶活性的下降和V含量的损失等，对保护枸杞果实的品质有一定积极作用。

PPO并不是耐热性的酶，因此通过高温短时热处理，可使其部分或全部不可逆地失活，从而抑制酶促褐变的发生。研究证实，70 ℃以上高温处理可以有效抑制枸杞鲜果中PPO的活性，且温度越高，完全抑制酶活性所用的时间越短。但过高温度处理又会加快V等营养成分的破坏，因此，枸杞PPO的抑制宜采用高温短时的热处理方式。朱金霞等综合考虑营养成分等情况，推荐80 ℃热处理3 min抑制枸杞酶促褐变。从加热方式上，微波加热及声热处理技术相较于传统的热传导、热对流及热辐射灭酶效果要好。

pH。当pH 3.0～8.0时，枸杞PPO的相对酶活性呈现双峰型曲线。据此推断枸杞中PPO可能具有同工酶或多种分子形式，刘威报道鲜果枸杞中PPO的最适pH为4.5，第2最适pH为7.0，且在酸性条件下活性相对较高。也有报道认为，第2最适pH是因为PPO是一种含铜的蛋白质，其中的铜离子在不同的pH条件下有不同的解离度，从而出现双峰型曲线。pH对PPO的影响在于改变酶表面的电荷影响其溶解度以及破坏其空间结构。当pH较低时，酶中的铜离子会被解离出来，使酶失活；当pH较高时，铜离子则与酶蛋白脱离，生成Cu(OH)，使酶失活。

其他物理方法。除了传统的温度、pH外，近年来，也有一些其他物理方法应用到枸杞PPO的抑制研究中。超高压通过改变生物体内大分子中的非共价键结构，能一定程度上钝化某些酶类的活性，但枸杞中的PPO普遍都有较强的耐压性。研究表明，枸杞鲜果在压力325.77 MPa、温度28.74 ℃条件下保持10.43 min，微生物残存数量可以达到国家安全食品最低标准，对PPO的活性影响不显著。黑果枸杞在300 MPa压力下PPO的活性并没有降低，而400 MPa以上高压才能使PPO活性降低至0.5 U/mL。600 MPa保压15 min，枸杞中的PPO仍然能保持一定的活性。高压处理相对于杀灭微生物，引起枸杞褐变的主要酶类都具有较高的耐压能力。仅靠高压处理来彻底钝化PPO，防止酶促褐变的效果不是很明显，需结合其他手段(如温度)来控制PPO活性。

气调贮藏可以通过有效地降低果蔬的呼吸作用、蒸发作用和抑制微生物生长，使得贮藏中的果蔬产品处于近类于休眠状态，让其正常的生理活动降低至最低程度。Selcuk等在0 ℃下评价了主动气调对枸杞鲜果的保鲜效果，发现2%O+5%CO可以抑制PPO的活性。

化学试剂不仅影响PPO的活性，同时也会影响PPO的构象。不同的化学试剂对于PPO的二级结构、三级结构的影响效果有着明显差别。根据抑制剂对酶促反应抑制的方式，PPO抑制剂主要有金属螯合剂、竞争性抑制剂、与氧化产物醌作用的还原剂、醌偶合剂、与酚类底物作用的化合物等。

金属螯合剂。CaCl中的Ca可与PPO中的Cu竞争，抑制PPO的活性。此外Ca还可与氨基酸反应形成非水溶性化合物，从而减少非酶褐变的发生。通过研究2个品种的枸杞酶学特性，发现当溶液浓度1.2 mol/L时，枸杞PPO相对酶活性均降至10%以下，且相对酶活性均随溶液浓度的增加而显著降低，抑制效果明显。因此，CaCl可作为枸杞鲜果PPO活性的优良抑制剂。CaCl结合其他抑制因素对枸杞PPO活性的抑制效果有待进一步研究。

竞争性抑制剂。芳香族羧酸是PPO很好的抑制剂，对酶类底物芳香族羧酸起竞争性抑制作用。水杨酸是一种简单的酚类化合物，被认为是一种新的植物内源激素，参与植物生长发育、成熟衰老等多方面的生理调控。适量浓度的水杨酸处理能显著降低果蔬PPO的活性，从而起到延缓果实褐变的作用。研究表明，1.0 mmol/L水杨酸处理能显著降低PPO的活性。此外，不同浓度的水杨酸浸泡处理能显著降低枸杞鲜果的腐烂率，延缓V的下降，提高过氧化氢酶(CAT)的活性，降低PPO的活性，减缓细胞膜的损伤，延缓果实衰老，延长鲜果贮存期。对其他果蔬的研究表明，水杨酸处理结合其他化学保鲜剂或者其他物理保鲜法效果更好，但复合处理对枸杞的处理效果目前没有报道。

还原剂。该类化合物能够和酚类的氧化产物醌作用，使醌还原为原来的底物，从而防止醌继续反应生成有色物质，从而抑制酶促褐变的发生。

抗坏血酸既是有机酸，又是还原剂。它既可以作为醌的还原剂，将氧化的醌还原为酚类物质，阻止醌类物质进一步自发聚合形成色素物质，又可以作为酶分子中铜离子的螯合剂，降低PPO的活性，它甚至可以被PPO直接氧化，这样又可以起到竞争性抑制剂的作用。同时，抗坏血酸能降低环境的pH，抑制酶活性。抗坏血酸对酶促褐变的抑制效果取决它的浓度。朱金霞等研究发现，红果枸杞和黄果枸杞鲜果的PPO活性均随抗坏血酸溶液浓度的升高而降低，浓度为88.0 mmol/L可完全抑制黄果枸杞PPO相对酶活性。

与氧化产物醌作用的还原剂除抗坏血酸外，还有二氧化硫、亚硫酸盐、巯基乙酸盐等，但有些不宜用做食品添加，因此限制其在枸杞中的使用。

醌耦合剂。这类化合物能够和醌作用，生成稳定的无色化合物，防止第二步酶促反应的继续发生。同时，这类化合物还能导致蛋白酶含量的增加，从而分解PPO，也能起到防止褐变的作用。

L-半胱氨酸是一种天然含硫氨基酸，可与酶促反应产物——醌类物质结合生成硫氢化合物，从而抑制酶促褐变。研究表明，L-半胱氨酸在较低浓度时就能较好地抑制鲜果枸杞PPO的活性，0.024 mmol/L时可完全抑制PPO的活性，可以作为首选抑制剂。

天然抑制剂具有安全、无毒、无残留的优势。具有PPO抑制作用的天然抑制剂主要有黄酮类、醛类、糖苷类、苯丙素类及真菌代谢物类，这些提取物中的抗氧化物可以保护枸杞中的酚类物质不被氧化。赵荣祥等研究了花椒、藿香、荷叶、丁香、丹参等18种植物提取物对PPO的抑制效果，结果表明，18种提取物均对鲜果枸杞的PPO活性有一定的抑制效果，其中以荷叶乙醇提取物和柠檬油提取物的抑制效果最为明显。

植物生长调节剂通过抑制PPO酶的活性或抑制抗坏血酸的下降及调节乙烯含量从而达到抑制酶促褐变的作用。

1-甲基环丙烯(1-MCP)能与乙烯受体结合，阻断乙烯信号传导，能较好地保持果实的完整性。赤霉素可降低PPO的生物合成以减少采后褐变。适当浓度的ClO可以阻止蛋氨酸分解为乙烯，且破坏已经形成的乙烯，抑制果实的衰老，对延缓枸杞鲜果的衰老有一定作用。ClO也能抑制V氧化酶的活性，减少V的损失。NO通过影响植物内部乙烯合成和内部NO代谢延缓果蔬衰老进程。NO能抑制细胞色素C氧化酶活性、线粒体呼吸链上复合体Ⅰ和复合体Ⅱ，与氧可逆性竞争而抑制呼吸链，导致线粒体产能过程受阻，从而抑制呼吸作用，延迟呼吸高峰的出现。NO熏蒸处理枸杞鲜果可显著降低枸杞鲜果呼吸速率和果实腐烂率。NO处理能显著抑制贮藏期枸杞PPO活性，有效降低果实的褐变度。同时，NO熏蒸可显著抑制果实中抗坏血酸含量下降。

4 其他方法

酶促褐变的发生需要3个条件：底物(多酚类物质)、氧介质、PPO。除了采用物理或化学方法抑制PPO活性外，隔绝空气也可以延缓酶促褐变的发生。

玉米醇溶蛋白是一种从玉米蛋白粉中提取的天然高分子材料，具有良好的成膜性，将玉米醇溶蛋白与80%的乙醇溶液1∶10涂抹于鲜果枸杞表面，可以抑制气体交换，降低呼吸速率，减少水分蒸发，防止微生物的大量生长，更好地保持营养成分和色泽。

壳聚糖是一种源自甲壳类动物的外壳及菌类、藻类的阳离子高分子多糖，喷涂于果实表面可形成一层透明的无色薄膜。该膜具有通透性、阻水性，对CO、CH和O有选择透过性，可延长果蔬贮藏保鲜时间。壳聚糖涂膜于鲜果枸杞，可一定程度抑制枸杞鲜果的腐烂和失水萎蔫，减缓V、可溶性固形物和可滴定酸含量的降低，保持果实良好的商品品质，延长保鲜期，其中以1.25%壳聚糖涂膜处理的枸杞鲜果的保鲜效果最佳。单一涂抹往往不能发挥最佳的保鲜效果，壳聚糖-山梨酸钾复合涂抹保鲜效果更好。

5 展望

不同抑制剂的抑制机理各不相同，相对而言，复合处理效果更好。如采用不同温度结合不同充气包装、壳聚糖结合山梨酸钾涂膜保存、1-MCP结合气调包装和以NO浸泡处理等复合处理效果均好于单独处理。

PPO的作用会导致枸杞的褐变，影响枸杞的品质。长期以来，枸杞的酶促褐变一直是影响枸杞产业发展的重要制约因素。随着人们对枸杞鲜果的需求不断增加，有关枸杞PPO引起的褐变也逐渐受到重视，未来有关枸杞PPO的酶学特性和影响因子的研究也将更加深入。