自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴细胞PD-1/PD-L1表达及其与肝功能指标的相关性

王变 沙敏 肖丽 李阳

自身免疫性肝炎是由自身免疫反应介导的一种慢性肝脏炎症性疾病，在临床中以Ⅰ型为主，其若不能得到及时有效控制，可并发肝性脑病、肝硬化等，严重者可发展为肝癌，给患者身体健康与生命安全带来严重危害[1-2]。因此，积极探讨影响自身免疫性肝炎病情进展的相关因子对临床评估患者病情及指导治疗具有十分重要的意义。目前，该病的病因及发病机制尚未得以完全阐明，但多认为自身免疫异常可能参与了疾病的发病过程[3]。已有研究指出，T淋巴细胞调节失控在自身免疫性肝炎的发生发展中起着关键作用[4]。程序性死亡因子-1（programmed death-1，PD-1）和程序性死亡因子配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）能够在T细胞活化以及增殖时供给负性共刺激信号，负调控免疫应答的活化，与自身免疫性疾病、恶性肿瘤免疫逃逸等密切相关[5-6]。相关研究报道，自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴细胞中PD-1高表达，可能参与了疾病的发生[7]。根据上述研究，虽然外周血T淋巴细胞中PD-1等在自身肝炎患者中的表达情况已有定论，但关于其表达情况是否与肝功能变化具有一定的相关性尚需进一步探讨。鉴于此，本研究旨在探索PD-1、PD-L1表达在自身免疫性肝炎患者病情进展中的意义，以期为该病的发病机制研究及临床治疗提供新方向及理论依据，详情如下。

资料与方法

1一般资料 经医院伦理委员会审批（伦理批准号：201512-003），选取2016年1月～2021年7月本院收治的131例自身免疫性肝炎患者设为疾病组，根据配对原则选取同期体检健康者112例设为对照组，另取93例临床资料均匹配的肝血管瘤手术患者作为肝血管瘤组。受试对象或家属均签署知情同意书。

纳入标准：（1）疾病组均符合自身免疫性肝炎诊断标准[8]，经肝活检确诊；（2）根据肝活检结果将疾病组患者分为轻度（肝活检显示，汇管周围散在片状坏死，肝小叶存在散在性坏死细胞，少于1/3汇管区有炎症细胞）、中度（＜50%汇管周围坏死，1/3～2/3肝小叶内变性，1/3～2/3汇管区有炎症细胞）与重度（≥50%汇管周围坏死，＞2/3肝小叶内变性，＞2/3汇管区炎症细胞密度增加）[9]；（3）患者均处于活动期，疾病类型为Ⅰ型，入院后均常规给予免疫抑制剂、保肝药物治疗；（4）对照组均为体检健康者，无心肝肾等疾病；（5）肝血管瘤组患者均为行肝血管瘤手术患者，肝功能Child-Pugh分级均为A级；（6）均无免疫抑制剂使用史。

排除标准：（1）酒精性或病毒性肝炎；（2）原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎者，或自身免疫性肝炎-原发性胆汁性胆管炎/原发性硬化性胆管炎重叠综合征；（3）药物引发肝损伤或遗传代谢性肝病等；（4）肿瘤；（5）胆结石或胆囊炎等其他肝胆疾病；（6）甲状腺功能亢进等内分泌疾病；（7）心脑血管疾病；（8）贫血、营养不良；（9）急性感染；（10）免疫系统疾病。

2方法

2.1外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达检测：均抽取受试者（对照组于体检时，疾病组于入院第二天，肝血管瘤组于手术前）空腹外周静脉血2 mL，经EDTA抗凝后，取150 μL全血分三等份，分别加入3支流式管中（A、B、C支），其中A、B支均加入小鼠抗人CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC与CD8-FITC单克隆抗体各10 μL，此外A支额外加入10 μL的鼠抗人PD-1-PE单克隆抗体，B支额外加入10 μL的鼠抗人PD-L1-PE单克隆抗体，另C支加入FITC-IgGⅠ、PE-IgGⅠ各10 μL作为同型对照；涡旋后，在室温下避光孵育30 min，加入450 μL的红细胞裂解液（经10倍稀释后），接着在室温下避光孵育15 min，完全溶血后，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，用300 μL的1%多聚甲醛重新悬浮细胞，立即采用流式细胞仪检测。用BD Cell Quest软件分析数据，以FSC与SSC设门进行细胞的读取，并以CD3和CD4双阳性圈定记作CD4+T细胞，而以CD3和CD8双阳性圈定记作CD8+T细胞，分别测定CD4+、CD8+T淋巴细胞的PD-1、PD-L1阳性比例。相关抗体试剂盒均购自美国BD公司，红细胞裂解液、PBS缓冲液均购自杭州联科生物技术股份有限公司，流式细胞仪（Cytomics FC 500）购自美国贝克曼公司。

2.2肝功能相关指标检测：均抽取受试者静脉血5 mL，离心、分离血清，应用贝克曼AU5800全自动生化分析仪检测血清总胆红素（total bilirubin，TBIL）、直接胆红素（direct bilirubin，DBIL）、间接胆红素（indirect bilirubin，IBIL）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、总蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、γ-谷氨酰转肽酶（gamma glutamyltranspeptidas，GGT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平。

3观察指标

3.1一般资料比较

3.2疾病组、肝血管瘤组、对照组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达水平比较。

3.3轻、中、重度自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达水平比较。

3.4疾病组、肝血管瘤组、对照组肝功能相关指标（TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、TP、ALB、GGT、ALP）比较。

3.5自身免疫性肝炎外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达水平与肝功能指标的相关性。

3.6不同肝功能Child-Pugh分级自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达情况。

4统计学方法 数据统计学分析采用SPSS 21.0软件，计量资料以（）表示，独立样本采用t检验，多样本计量资料采用单因素方差分析与SNK-q检验；计数资料以“例/%”表示，采用χ2检验；采用Pearson相关性分析法分析外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达水平与肝功能指标的相关性；P＜0.05表示差异有统计学意义。

结果

1一般资料 三组在性别、年龄方面比较差异无统计学意义（P＞0.05）；疾病组与肝血管瘤组的病程比较差异无统计学意义（P＞0.05）；疾病组与肝血管瘤组的病情严重程度、肝功能Child-Pugh分级方面比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 一般资料比较

2疾病组、肝血管瘤组、对照组外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达水平 疾病组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞中的PD-1、PD-L1表达率均明显高于肝血管瘤组与对照组（P＜0.05）；肝血管瘤组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；见表2。

表2 各组外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达水平比较（，%）

表2 各组外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达水平比较（，%）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与肝血管瘤组比较，bP＜0.05。

3轻、中、重度自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达水平 外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达率在轻度、中度、重度自身免疫性肝炎患者中逐渐升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3和图1-4。另对照组、肝血管瘤组外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达情况分别见图5、图6。

图1 轻、中、重度患者PD-1/CD4+表达水平（横坐标均表示CD4+T淋巴细胞，纵坐标均表示PD-1表达情况）

图2 轻、中、重度患者PD-1/CD8+表达水平（横坐标均表示CD8+T淋巴细胞，纵坐标均表示PD-1表达情况）

图3 轻、中、重度患者PD-L1/CD4+表达水平（横坐标均表示CD4+T淋巴细胞，纵坐标均表示PD-L1表达情况）

图4 轻、中、重度患者PD-L1/CD8+表达水平（横坐标均表示CD8+T淋巴细胞，纵坐标均表示PD-L1表达情况）

图5 对照组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达水平（横坐标分别表示CD4+、CD8+T淋巴细胞，纵坐标分别表示PD-1、PD-L1表达情况）

图6 肝血管瘤组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达水平（横坐标分别表示CD4+、CD8+T淋巴细胞，纵坐标分别表示PD-1、PD-L1表达情况）

表3 不同疾病程度患者外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达水平比较（，%）

表3 不同疾病程度患者外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达水平比较（，%）

注：与轻度比较，aP＜0.05；与中度比较，bP＜0.05。

4疾病组、肝血管瘤组、对照组肝功能相关指标水平 疾病组血清TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、ALP水平均明显高于肝血管瘤组与对照组（P＜0.05），TP、ALB水平均低于肝血管瘤组与对照组（P＜0.05）；肝血管瘤组肝功能相关指标水平与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；见表4。

表4 各组肝功能相关指标水平比较（）

表4 各组肝功能相关指标水平比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与肝血管瘤组比较，bP＜0.05。

5自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达与肝功能指标的相关性 经Pearson相关性分析，自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞中的PD-1、PD-L1表达率与TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、ALP水平均呈明显正相关（P＜0.05），与TP、ALB水平均呈负相关性（P＜0.05），见表5。

表5 自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达与肝功能指标的相关性

续表5

6不同肝功能Child-Pugh分级自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达情况 外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达率在自身免疫性肝炎患者肝功能Child-Pugh分级A、B、C级中依次升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表6。

表6 不同肝功能Child-Pugh分级患者外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达比较（，%）

表6 不同肝功能Child-Pugh分级患者外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达比较（，%）

注：与A级比较，aP＜0.05；与B级比较，bP＜0.05。

讨论

自身免疫性肝炎属于免疫损伤性肝脏疾病，其可进展为肝硬化或肝衰竭，严重影响患者生存[10-11]。现阶段，尽管自身免疫性肝炎的发病机制仍未完全清楚，但自身免疫异常在其发病中的作用已得到明确[12-13]。PD-1、PD-L1可抑制T细胞活化与增殖，对免疫应答具有负性调控的作用[14-15]。本研究特探讨自身免疫性肝炎患者外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1的表达及其与肝功能的相关性，以期为临床工作提供指导。

PD-1属于免疫细胞负性共刺激分子，与其配体PD-L1相结合后，能够传入抑制信号而对T淋巴细胞活化与增殖发挥抑制作用[16]。PD-1/PD-L1信号通路在淋巴细胞免疫应答的初始部位及效应阶段具有双重作用，可适时阻止过强的免疫应答，以维持免疫功能稳定，从而可避免发生自身免疫性疾病[17-18]。本研究中，自身免疫性肝炎外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞中的PD-1、PD-L1表达率均较健康人群与肝血管瘤患者高，且随病情加重而逐渐升高，此与理论上PD-1、PD-L1在自身免疫性疾病中应表达下调不相符合，可能是因在机体效应T淋巴细胞激活的同时，虽然PD-1、PD-L1表达逐渐增多，但表达PD-1与PD-L1的CD4+、CD8+T淋巴细胞的增殖能力却出现下降的情况，并未达到下调免疫应答和抑制自身免疫的效果，考虑其升高可能是机体对自身免疫的一种代偿，通过增加PD-1、PD-L1的表达以实现负调控T淋巴细胞的目的，抑制过强的免疫反应而造成的肝细胞损伤，但该自身代偿反应作用有限，增高的PD-1、PD-L1对免疫反应的下调并不足以阻止疾病的进一步发展[19-20]；亦可能是正性刺激过强，超过了PD-1/PD-L1通路的负性抑制作用，或是该通路在共刺激通路中发生了功能障碍，促使免疫耐受失衡，不能发挥抑制性调控免疫反应的作用，导致病变发生[21-22]。PD-1/PD-L1通路并不能够对活化T细胞增殖分化的速度与强度进行有效控制，最终导致了自身免疫性肝炎的发生[23]。芮志莲[24]研究报道，自身免疫性肝炎患者外周血CD8+T细胞PD-1表达水平较健康人群明显升高，与本研究结果相似。另熊克宫等[25]研究表明，Ⅰ型自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞PD-L1的表达均高于健康者，此与本研究结果相一致。另本研究中，疾病组血清TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、ALP水平均较对照组与肝血管瘤组明显升高，而TP、ALB水平较对照组与肝血管瘤组降低，表明自身免疫性肝炎患者存在肝功能受损情况。肝细胞坏死是自身免疫性肝炎的主要病理特征之一，可导致肝功能降低[26-27]。肝血管瘤属于肝脏良性肿瘤，一般对肝功能无影响，肝功能通常在正常状态。

此外，本研究结果还发现，自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞中的PD-1、PD-L1均与TBIL、DBIL、IBIL、ALT、AST、GGT、ALP水平均呈明显正相关，而与TP、ALB水平呈负相关性，另其在自身免疫性肝炎患者肝功能Child-Pugh分级A、B、C级中均依次升高，表明外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞中的PD-1、PD-L1表达与自身免疫性肝炎患者肝功能密切相关。当自身免疫性肝炎进展时，为维持免疫耐受状态，机体过表达PD-1、PD-L1，以发挥负性调控T淋巴细胞的作用，避免过度免疫反应所致的肝细胞损伤[28-30]。相关研究[31]表明，自身免疫性肝炎患者肝组织中PD-L1的表达与肝功能指标TBIL、ALT、GGT、ALP水平呈正相关，此与本研究结果相一致。PD-1、PD-L1在自身免疫性肝炎发病进展中具有重要作用，与肝功能密切相关，此对临床治疗具有一定的指导作用。

综上，自身免疫性肝炎患者外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达均升高，且与肝功能关系密切。本研究的创新之处在于通过对外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1表达情况与自身免疫性肝炎患者肝功能关系的探索分析，为临床疾病进展的预测与治疗提供了指导，可作为评估机体是否存在一定程度的免疫紊乱的参考指标，并有助于推动自身免疫性肝炎抑炎和免疫调节治疗新策略的发展。但本研究尚存在一定的不足，纳入研究的样本量相对较少，并未对外周血T淋巴细胞中PD-1、PD-L1影响肝功能的具体机制进行探讨分析，且因PD-1、PD-L1在机体内的表达具有广泛性，后续仍需扩大样本量进行深层次的研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突