NaCl胁迫对不同种质藜麦种子萌发特性的影响

张业猛，朱丽丽，李万才，赵亚利，陈志国

（1.中国科学院 西北高原生物研究所，青海 西宁 810008；2.中国科学院大学，北京 100049；3.中国科学院 高原生物适应与进化重点实验室，青海 西宁 810008；4.青海省作物分子育种重点实验室，青海 西宁 810008；5.青海省互助县种子站，青海 海东 810500；6.青海省海东市乐都区种子站，青海 海东 810700）

【研究意义】土壤盐碱化不仅是全球范围内严峻的环境问题，也是制约农作物生长的主要非生物胁迫因素[1]。据统计，全世界盐碱地面积已经超过8亿hm2[2-3]，其中我国盐碱地约有0.36亿hm2，占总耕地面积的5%[4]。盐碱地作为我国重要的土地后备资源，如何利用盐碱化土壤，保障我国耕地和粮食安全，选育抗盐碱性强的作物不失为一条有效途径，耐盐作物的种植不仅可以改善农业生态环境，也能促进农业生产的发展[5-6]。藜麦（Chenopodium quinoaWilld）为苋科藜属一年生叶草本植物，是喜冷凉的高海拔作物，在自然肥力较低的环境下仍能生长良好，而且具有耐寒、耐旱、耐盐碱和耐瘠薄等特征[7-10]。因此，在土壤盐碱化日益加剧的情况下，筛选耐盐碱性较强的藜麦品种具有重大的理论意义和实践价值。【前人研究进展】作物生产中，保苗是构建群体的基础，种子萌发阶段是作物生活史中对外界环境最敏感的时期，对作物群落数量和结构都具有决定性作用[11]。近年来，随着盐胁迫对农作物种子萌发特性影响的深入，耐盐性种质资源筛选多基于多指标综合评价方法，且小麦[12]、玉米[13]和水稻[14]等作物的抗性筛选和鉴定已取得较完善的结果。李媛媛等[12]利用150 mmol/L NaCl和100 mmol/L NaHCO3/Na2CO3（1∶1）混合溶液分别模拟盐和碱胁迫对小麦萌发期耐盐碱材料进行筛选鉴定，最终得到10 份耐盐碱型小麦品种。孙璐等[15]利用150 mmol/L NaCl 模拟盐胁迫进行高粱品种萌发阶段抗盐性筛选，并采用主成分和相关性分析进行抗盐性综合分析，发现幼苗根长、叶重和发芽率是衡量高粱耐盐性的重要指标。于莹等[13]通过隶属函数对31份玉米自交系耐盐碱性进行综合评价，共筛选出耐盐碱品系6个，中毒耐盐碱品系14个，盐碱敏感品系5个。【本研究切入点】藜麦作为盐生植物，相比于水稻、大麦和小麦等具有较高的耐盐性[2]。但不同藜麦品种之间对盐胁迫耐受性也存在显著差异[16]，且高浓度的NaCl即便不降低藜麦的发芽率，也会增加萌发时间[17]。【拟解决的关键问题】本研究对不同来源的藜麦种质资源在种子萌发阶段的表现进行综合分析，明确其苗期鉴定指标，有效筛选出抗性较强和敏感的种质，为藜麦的耐盐性生理基础及其分子机制提供丰富的基因型资源[18]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参试的125份藜麦种质资源分别来自国内各藜麦种植单位提供的资源，其中1-214号系青海三江沃土生态农业科技有限公司提供（因部分种质资源不适合青海地区种植，已淘汰），JQ151 系山西稼祺农业科技有限公司提供，2021年本实验室统一自繁保留。

1.2 试验方法

分别挑选籽粒饱满、大小一致的种子，用体积分数75%的乙醇溶液消毒5 min后，无菌水冲洗至干净无味，用滤纸吸取种子表面水分，平整铺放在放有2层滤纸的种子萌发盒中，每盒放置50粒种子，分别加入12 mL蒸馏水（对照）和NaCl溶液，置于12 h（25 ℃）光照/12 h（20 ℃）黑暗条件的人工气候培养箱中进行萌发试验，每组处理3次重复。根据前期对盐胁迫处理条件的摸索，NaCl浓度定为300 mmol/L[19]。

1.3 测量指标

以胚根伸出种皮2 mm 计为萌发，每隔24 h 记录萌发情况，记录时间为7 d。7 d 后，每个处理分别取5 株测量胚芽长、胚根长、鲜重和干重（105 ℃2 h 杀青，80 ℃烘至恒重）。发芽率和萌发时间的计算依据以下公式：

式（2）中f是在i天萌发的数量。

1.4 数据处理

采用Excel 2010 对数据进行统计处理，GraphPad Prism 9.2.0 进行差异分析，R 语言进行相关性分析和主成分分析，TBtools进行聚类分析[20]。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对不同藜麦种质萌发的影响

由表1可知，不同参试藜麦种质资源在300 mmol/L NaCl胁迫条件下，萌发率、萌发时间、干重、鲜重、胚芽长和胚根长均存在显著差异；对照处理条件下，各项萌发指标也存在显著差异；说明藜麦种质资源类型丰富，且不同品种间对盐胁迫的耐受性存在显著差异。虽然藜麦为盐生作物，但是高浓度的盐胁迫也会降低藜麦的萌发率，延长萌发时间，降低鲜重、降低胚芽长和胚根长的生长伸长缩短；值得注意的是，盐胁迫条件下藜麦干物质积累增加（图1）。

图1 不同处理下藜麦萌发指标的方差分析Fig.1 Analysis of variance on germination indicators of quinoa under different treatments

表1 NaCl胁迫下不同藜麦品种的变异分析Tab.1 Variation analysis of different quinoa varieties under NaCl stress

2.2 藜麦萌发阶段各指标的相关性

相关性分析图2 显示，萌发率与萌发时间和干重呈极显著的负相关，与鲜重、胚芽长和胚根长呈极显著的正相关。萌发时间与干重呈极显著正相关，与鲜重、胚芽长和胚根长呈极显著的负相关。干重与鲜重、胚芽长和胚根长呈极显著的负相关。鲜重与胚芽长和胚根长呈极显著的正相关。胚芽长与胚根长呈极显著的正相关，表明6 项萌发指标间存在信息重叠，需要进一步进行降维分析，从而筛选重要的萌发指标。

图2 藜麦萌发指标相关性分析Fig.2 Correlation analysis of quinoa germination indicators

2.3 藜麦萌发阶段主成分分析

通过KMO 和Bartlett 检验后发现，Bartlett 球形检验的近似卡方（Approx.Chi-squar）为171.12，自由度（degree of freedom）为15，显著性P=0，小于0.05，说明数据适合做主成分分析。

采用主成分分析对萌发率（X1）、萌发时间（X2）、干重（X3）、鲜重（X4）、胚芽长（X5）和胚根长（X6）进行比较，对参试藜麦种质资源进行耐盐性综合评价。根据结果，取特征根大于1 的Pc1 和Pc2 进行主成分分析（图3A、图3B）。通过Pc1 可以明显区分对照组和实验组区之间的差异。此外，Pc1 与鲜重、胚芽长、萌发率和胚根长呈正相关，与萌发时间呈负相关；Pc2 与干重呈正相关（表2）。以300 mmol/L NaCl胁迫处理条件下的6 项萌发指标为参考，对主成分综合得分进行排序。Pc1 和Pc2 与6 项萌发指标的线性关系分别为：YPc1=0.733X1-0.573X2+0.001X3+0.783X4+0.753X5+0.666X6，YPc2=0.371X1-0.382X2+0.848X3-0.026X4-0.250X5-0.425X6。用Pc1 和Pc2 特征值占总特征值的比例为权重，对主成分综合得分ZF=41.50%YPc1+20.77%YPc2进行排序（表3）。耐盐株具有较高的萌发率、鲜重、胚芽长和胚根长，且较短的萌发时间（图4）。

图4 藜麦萌发第7天照片和各项指标分析Fig.4 The 7th day photo of quinoa germination and the radar map of various germination indicators

表3 参试藜麦品种抗盐性总得分排序Tab.3 Ranking of total salt resistance scores of quinoa varieties tested

图3 藜麦萌发指标主成分分析Fig.3 Principal component analysis of quinoa germination indicators

表2 主成分载荷值和得分系数Tab.2 Loading value of principal components and score coefficients

2.4 藜麦萌发阶段聚类分析

对300 mmol/L NaCl 胁迫处理条件下125 份藜麦种质资源萌发阶段的6 项指标进行聚类分析，分为3 组（图5）。萌发率、鲜重、胚芽长和胚根长聚为一类，干重和萌发时间聚为一类，与方差分析、相关性分析和主成分分析结果一致。I 组包括36 个藜麦种质资源，相比II 和III 组，其萌发率、胚芽长、胚根长、鲜重和干重较高，萌发时间较短；与主成分综合得分排名一致。II 和III 组分别包括38 和51 个种质资源，具有较长的萌发时间，而萌发率、胚芽长、胚根长和鲜重较低，耐盐性较差。

图5 125份藜麦种质资源聚类分析Fig.5 Cluster analysis of 125 quinoa germplasm resources

3 讨论与结论

藜麦萌发期是对盐胁迫最敏感的时期，耐盐性是自身遗传物质通过调控多种代谢过程应答外界盐胁迫的综合表现。在实验室内模拟盐胁迫，避免田间环境多变的影响，从中筛选耐盐和敏感的种质资源，为进一步开展相关耐盐分子机制的挖掘提供参考。

在胁迫条件下，种子萌发期对作物群体构建和后期生长发育具有决定性作用[21]，可作为衡量作物在逆境下的耐受性，具有耗时短、重复性好和操作性强等优点[22]。藜麦耐盐性是由多基因调控的数量性状，耐盐机制较为复杂[23]，并没有单一指标可以作为耐盐性鉴定的依据，通常以发芽率和萌发时间反映种子萌发的活力和速率，胚芽和胚根长度反映种子的发芽速率和对逆境的耐受性，鲜重和干重反映种子幼苗能量转化情况[18]。在前期已获试验结果的基础上，本试验采用300 mmol/L NaCl模拟盐胁迫，发现在蒸馏水培养条件下，不同藜麦种质资源萌发阶段的萌发率、萌发时间、干重、鲜重、胚芽长和胚根长存在显著差异；NaCl 胁迫导致萌发时间显著增长，萌发率、鲜重、胚芽长和胚根长显著降低，大多数种质资源的干重显著增加。表明藜麦种质类型丰富，高浓度盐胁迫对藜麦的生长具有显著的抑制，与Gómez-Pando 等[24]研究结果一致。方差分析显示，不同藜麦种质对盐胁迫的耐受性存在显著差异，可能是由于遗传变异造成种子内部结构和调控机制产生差异导致的[9,25]。因此，探索不同基因型的藜麦种质资源对盐胁迫的耐受性，对其进行耐盐性进行综合评价，不仅为藜麦的耐盐机制研究提供种质资源，也可以提升耐盐性较强的藜麦种质资源在藜麦耐盐改良育种过程的利用。

作物耐盐性评价方法较多，如聚类分析[26]、主成分分析[18]、灰色关联度[27]、隶属函数[28]等方法。其中，主成分分析又名因子分析，可以用相对少的几个因子解释多变量间的关系，探索对结果起支配作用的统计分析方法，结合系统聚类法对耐盐性进行划分，有利于对藜麦种质耐盐性进行正确评价[29-30]。本试验通过相关性分析，发现6项萌发指标存在极显著的相关性，存在较大的信息重叠。进一步主成分分析可以将其分为2个主成分，第一主成分中鲜重、胚芽长、萌发率和胚根长载荷值较大，且可以显著将对照组和实验组区分，可以作为藜麦萌发期抗盐性的主要鉴定指标。取主成分分析结果得到的耐盐株（115 和55号）与敏感株（147和197）进行6项指标比对，发现耐盐性好的品种具有较高的萌发率、鲜重、胚芽长和胚根长，较短的萌发时间，与方差分析结果一致。通过聚类分析对125 份藜麦种质资源在300 mmol/L NaCl胁迫下的萌发指标进行评价，发现I组在萌发期的耐盐性表现较好，III组次之，II组最差。通过排序和分类结果显示与试验过程中表现趋势基本一致，说明结合主成分和聚类分析进行藜麦萌发期抗盐性评价结果较可靠，可以有效筛选耐盐鉴定指标和耐盐株。

致谢：中国科学院种子创新研究院（INASEED）基金项目同时对本研究给予了资助，谨致谢意！