禁食和非禁食两种生理状态下大鼠口服绿原酸后血浆主要代谢物及生物利用度研究

张建军，罗秋水，2，李青青，周 强，熊建华，2*

（1.江西农业大学 食品科学与工程学院，江西 南昌 330045；2.南昌市农产品加工与质量控制重点实验室，江西南昌 330045）

【研究意义】绿原酸（chlorogenic acid，CGA）又名3-O-咖啡酰奎宁酸，咖啡酰奎宁酸类化合物重要成员之一，是植物有氧呼吸过程中通过莽草酸途径产生的一种多酚类化合物[1-2]，广泛存在于杜仲、金银花和各种水果及蔬菜中[3-6]，因其具有较好的生物学作用包括清热、解毒、抗炎和抗菌等而受到广泛关注[7-8]，其也是许多中草药和草药复方制剂品质的主要评价指标，但关于CGA 口服后代谢与生物利用度的报道并不多。鉴定CGA 口服后血浆中的主要代谢物，并研究其吸收规律与生物利用度，为CGA 的应用提供数据参考。【前人研究进展】绿原酸具有较广泛的生物活性，Chen 等[9]研究表明，CGA 可以通过抗凋亡作用、抑制神经炎症和氧化应激对神经元产生保护作用，从而对创伤后应激障碍的治疗产生积极作用。Liu 等[10]发现CGA 处理3T3-L1细胞后，细胞脂质和甘油三酯水平显着降低，表明其具有抑制脂肪生成的作用。CGA 还可以降低血清尿酸并抑制黄嘌呤氧化酶（XOD）活性，以减轻高尿酸血症并减轻肾脏炎症[11]。此外它也是国家卫生健康委员会办公厅、国家中医药管理局办公室发布《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第4版）》及以后版本中推荐中成药金花清感颗粒、莲花清瘟胶囊重要组分金银花的活性成分。部分CGA 的体内代谢物也具有较好的生物学功能。Odunayo 等[12]在他们的研究发现，咖啡酸（caffeic acid，CA）通过增加过氧化物酶活性而表现出降低血压和保护心脏的特性。Santana-Gálvez 等[13]和Baeza等[14]研究得出二氢咖啡酸（dihydrocaffeic acid，DHCA）对大多数癌细胞系显示出增加的细胞毒性和对氧化损伤的显着保护。Williamson等[15]也报道了CGA的代谢产物通过间接作用调节血糖，从而预防Ⅱ型糖尿病。CGA 在自然界中广泛存在，但含量较高的植物并不多[16]。本研究团队前期对金银花细胞高效积累CGA进行研究，发现利用茉莉酸甲酯、水杨酸和紫外的组合诱导子作用于金银花悬浮细胞可以增加其CGA 中含量[17]。在获得了更高的CGA 产量后，人们仍然希望有限量的CGA 能够在生物体中得到充分利用。【本研究切入点】CGA作为常见的膳食多酚之一，在日常生活中一般正常饮食状态下从食物中获得[18]。然而，人们对CGA体内代谢的关注力主要集中在禁食状态下，这种状况不能真实表现CGA体内代谢，研究CGA 在禁食（fasted，FT）和非禁食（non-fasted，NF）两种生理状态体内代谢及生物利用情况具有实际意义。【拟解决的关键问题】本研究拟使用UPLC-QTOF-MS鉴定出大鼠口服CGA后血浆中主要的代谢物，优化主要代谢物的UPLC-QQQ-MS 定量方法，并利用其研究大鼠禁食和非禁食两种生理状态口服CGA后血浆中代谢动力学，分析CGA的生物利用度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

CGA（纯度大于95%）：诱导的金银花细胞由江西农业大学食品科学与工程学院提供[16]，采用10倍细胞质量的60%乙醇溶液70 ℃提取，提取液挥发乙醇，通过HPD 500 和Sephadex LH-20 色谱材料分离纯化，经质谱及标准品对照鉴定[19]。雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（体质量290～330 g）：购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

芦丁和CGA 的标准品（纯度为99%）：购自Merck 公司（Darmstadt，Germany）。色谱级甲醇和乙腈购自安徽泰达高纯度溶剂有限公司。超纯水使用Milli-Q 纯化系统制备，其他所有试剂均采用分析级的试剂。

1.2 试验动物和处理

大鼠被饲养在23～25 ℃、相对湿度为（60±15）%、光/暗周期为12/12 h 的环境中，自由饮食取水，所有试验遵守江西农业大学动物管理和试验条例。

适应1周后，将48只大鼠随机分为禁食组（FT）和非禁食组（NF），再将每组大鼠均分为4小组（n=6），其中3组分别口服2 mL剂量浓度分别为25，50，100 mg/kg（bwt）CGA水溶液，另1组口服等量的蒸馏水作为对照组。8 小组分别为禁食1（FT1）、禁食2（FT2）、禁食3（FT3）、禁食4（FTC）组和非禁食1（NF1）、非禁食2（NF2）、非禁食3（NF3）、非禁食4（NFC）。FT组在动物试验前，禁食不禁水一夜，而NF组则是实验前正常给予AIN-93G饲料[20]和水，口服对应剂量CGA溶液后0.083，0.167，0.5，1，2，3，4，6 h时间点分别从大鼠尾静脉[21]采集血样（约200 μL），放入含有K2-EDTA的离心管中。所有血样4 ℃，离心半径8 cm，5 000 r/min，离心10 min，然后收集上层的血浆样品储存于-80 ℃冰箱。

1.3 血浆样品的预处理

将50 μL 的血浆样品与200 μL 的含乙酸的甲醇（体积分数2%）进行混合，混合后涡旋混匀2 次（每次2 min），中间间隔2 min，充分作用，再于4 ℃，离心半径8 cm，12 000 r/min，离心10 min，沉淀血浆中的内源性蛋白，上清液保存并用于UPLC-QTOF-MS 分析血浆中CGA 主要代谢物。另取50 μL 血浆以同样的方法处理，且在涡旋前加入5 μL 含有芦丁（0.2 μg/mL，IS）的甲醇溶液，得到的上清液用以UPLCQQQ-MS进行代谢物定量分析。

1.4 UPLC-QTOF-MS鉴定血浆中CGA及其主要代谢物

采用超高效液相Shimadzu LC-30A（Shimadzu Corporation，Kyoto，Japan）串联AB Sciex Q-TOF 5600-plus 质谱仪（AB Sciex Corporation，Foster City，CA）鉴定血浆中CGA 及其主要代谢物。采用ZORBAX RRHD EclipsePlus C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Agilent Technology，Wilmington，DE，USA）进行色谱分离。流动相为0.1%甲酸水（流动相A）和乙腈（流动相B）。洗脱梯度为0.01～15 min，5%～40%（B）；15～30 min，40%～95%（B）；30～32 min，95%～95%（B）32～32.1 min，95%～5%（B）。流速为0.3 mL/min，进样量2 μL。质谱检测在负离子全扫描模式下进行，质量范围为m/z50～1 000。超纯氮气作为离子源气体1（50 psi），离子源气体2（50 psi）和帘式气体（40 psi）。离子源的喷雾电压和离子源温度分别为-4 500 V和500 ℃。离子源、碰撞能量和扩散碰撞能量分别设置为100，-40，10 V。用Analyst 1.6软件（AB Sciex）和PeakView进行数据采集和分析。

1.5 CGA及代谢物UPLC-QQQ-MS定量检测条件

1.5.1 色谱和质谱条件AB Sciex4500 三重四极杆质谱仪串联Shimadzu LC-30A 液相色谱仪定量分析血浆中CGA 及其代谢物。扫描方式为负离子模式，多级反应监测模式（MRM），质谱参数为：离子喷雾电压-4 500 V，温度500 ℃，离子源气体1（40 psi），离子源气体2（50 psi），帘式气体（40 psi）。去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）、射入电压（EP）、碰撞室射出电压（CXP）分别设定为-60，-25，-10，-17 V。使用ZORBAX RRHD EclipsePlus C18 柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）进行色谱分离。流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液。洗脱梯度为0.01～0.5 min，5%～5%（B）；0.5～2.5 min，5%～95%（B）；2.5～5 min，95%（B）；5～5.1 min，95%～5%（B）；5.1～7 min，5%（B）。流速为0.3 mL/min，柱温为（30±5）℃，进样量为2 μL。

1.5.2 方法学考察CGA和芦丁标准工作溶液均用含有乙酸（2%，V/V）的甲醇制备，CGA的标准工作溶液的最终质量浓度范围为1～5 000 ng/mL，芦丁标准工作溶液的最终质量浓度为10 μg/mL。将5 μL CGA工作标准溶液加入45 μL禁食空白大鼠血浆（来自FTC组）中用于制备校准曲线和质量控制样品，并按上述血浆处理方法进行处理。校准曲线中的CGA 质量浓度从1～200 ng/mL，定量下限（LLOQ）取10 倍信噪比（S/N）对应的分析物浓度，质控样品中CGA 的最终质量浓度为5，25，150 ng/mL。为了确定日内精度和准确度，在同一天多次分析了低、中、高浓度的质控样品，并在一个月内随机3天对日间精密度和准确度进行评估。

1.6 药代动力学分析

计算每个时间点的血浆样本中CGA 浓度、代谢物与内标（芦丁）峰面积比。使用PKSolver V2.0 药代动力学软件[22]进行非房室模型药代动力学分析，并计算相关参数：最大血药浓度（Cmax）、达峰时间（Tmax）、血药浓度时间曲线下面积（AUC）、消除半衰期（t1/2）、平均停留时间（MRT）和清除率（CL）。

1.7 统计分析

数据以3个重复的平均值±标准差表示。使用SPSS软件22.0版对数据进行了分析和图表绘制，统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行，P＜0.05时差异具有统计学意义。

2 结果和分析

2.1 CGA大鼠血浆主要代谢物

通过UPLC-QTOF-MS 对FT 组和NF 组大鼠口服CGA 后0.167，0.5，1，2 h 的血浆样品主要代谢物进行鉴定。

图1显示CGA在大鼠体内的模拟代谢途径和主要代谢物，各主要代谢物的详细数据见表1，在FT组中检测到10 种主要代谢物，分别为：甲基绿原酸（methylated CGA，CGA-Methyl）、绿原酸葡萄糖醛酸（CGA glucuronide，CGA-Glu）、咖啡酸（caffeic acid，CA）、咖啡酸葡萄糖醛酸（CA glucuronide，CA-Glu）、阿魏酸（ferulic acid，FA）、阿魏酸葡萄糖醛酸（FA glucuronide，CGA-Glu）、阿魏酸硫酸（FA sulfate，CGA-Sul）、二氢咖啡酸（dihydrocaffeic acid，DHCA）、奎宁酸（quinic acid）和苯甲酸（benzoic acid，BA）。而NF组中未检测到CA，只有9种，可能是因为CA代谢速度非常快，受食物影响未能及时吸收进而被酶作用代谢成其他形式了。而硫酸化的CGA和CA也没有被发现，这可能是由于CGA和CA与硫酸盐结合不稳定、易分解。

表1 大鼠血浆中CGA和CGA代谢物的UPLC-QTOF-MS信息Tab.1 UPLC-QTOF-MS information of CGA and CGA metabolites in rat plasma

图1 CGA在大鼠体内预测的代谢物结构和代谢途径Fig.1 Predicted metabolite structures and metabolic pathways of chlorogenic acid in rats

CGA 的分子式为C16H18O9，[M-H]-为m/z353.084 8，它的主要特征碎片离子为m/z191，是由CA 和QA之间的酯键断裂形成的。CGA-Methyl 和CGA-Glu 的[M-H]-为m/z367.102 1 和529.120 5，分别比去质子的CGA 高14 Da（甲基）和176 Da（葡萄糖醛酸），它们的主要碎片离子为m/z191，这与CGA 相同，也是由CGA中的酯键断裂形成。

CA 的[M-H]-为m/z179.035 3，主要特征碎片离子为m/z135，这是由CA 丢失一个羧基所形成的。CA-Glu的[M-H]-为m/z355.065 9，失去葡萄糖醛酸后，它的碎片离子与CA相同，在Azuma等[23]的试验中，大鼠腹腔注射CGA后，血浆中迅速检测到CA-Glu，由于血浆和肝脏中的酯酶不具备水解活性，因此CAGlu 也可能来自于CGA 葡萄糖醛酸化时的酯键断裂。DHCA 是由CA 中的双键氢化产生的，它的分子式比CA多两个氢，其[M-H]-为m/z181.047 8。

FA 是CA 的一个甲基化合物，[M-H]-为m/z193.046 3，比CA 多14 Da。在血浆中也鉴定出了FA 的葡萄糖醛酸化合物和硫酸化合物。

QA 的[M-H]-为m/z191.056 4，但由于QA 结构不稳定使其很容易在大肠内就被代谢为苯甲酸[M-H]-为m/z121.029 6。

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2.2 CGA及其代谢产物UPLC-QQQ-MS定量方法

由于血浆中存在许多干扰物质，在分析前需要对样品进行预处理。目前，广泛使用的生物样品制备方法有蛋白质沉淀、固相萃取和液-液萃取法，对以上预处理方法均进行了研究。结果表明使用4 倍含有2%乙酸的甲醇作为血浆蛋白质沉淀剂进行预处理，操作简单、除杂效果好。

2.2.1 专属性在空白样品中没有明显的峰值，空白加标样品血浆中CGA 和芦丁的保留时间为3.10 和3.12 min，在保留时间内没有发现明显的干扰，UPLC-QQQ-MS/MS色谱图见图2。

图2 CGA和芦丁的UPLC-QQQ-MS/MS色谱图Fig.2 UPLC-QQQ-MS/MS chromatogram of CGA and Rutin

2.2.2 线性度和定量下限（LLOQ）通过绘制峰面积比（CGA/芦丁）与CGA 浓度（血浆浓度为0.4，0.8，2.4，4，10，20，40，60，120，160，200 ng/mL）的关系，得到校准曲线，线性回归方程为Y=70.488X+0.180 2，R2=0.999 2，其中Y为峰面积比（CGA/芦丁），X为血浆中CGA 的浓度（ng/mL），大鼠血浆中CGA 的定量下限为0.2 ng/mL。

2.2.3 精密度和准确度CGA 的日内和日间精密度（RSD）在10%，质控样品（QC）的准确度在92.3%～102.2%（表2），所以该检测方法的精密度和准确度较好。

表2 血浆样品中CGA的日内和日间精密度以及准确度（n=5）Tab.2 The intra-day and inter-day precision and accuracy of CGA in plasma samples

2.2.4 回收率和基质效应对基质效应进行测定，以评估离子增强或抑制的效应，在3 种浓度的质控样品中，CGA 的基质效应范围为89.5%～94.3%，芦丁为90.1%。3 种浓度下血浆中CGA 的总体平均回收率为89.2%～90.0%，芦丁为93.1%（表3）。由此可知基质效应和回收率都在可接受的范围内。

表3 血浆中CGA和芦丁的提取回收率和基质效应（n=5）Tab.3 Extraction recoveries and matrix effects of CGA and rutin from plasma

2.3 禁食和非禁食条件下血浆中CGA及其代谢物的生物利用

用UPLC-QQQ-MS/MS 法定量口服CGA 后大鼠血浆中的CGA 及其代谢物，根据UPLC-QTOF-MS 获得的[M-H]-和MS2，为每个代谢物的MRM 分析选择离子对，分别为：m/z190.8/353.4（CGA），353.1/529.1（CGA-Glu），191.0/367.1（CGA-Methyl），179.0/135.0（CA），135.0/355.1（CA-Glu），134.0/193.0（FA），178.0/369.1（FA-Glu），193.0/273.0（FA-Sul），135.0/181.1（DHCA）。芦丁（IS）的离子对为m/z609.2/300，并用峰面积比（CGA/IS）校准曲线来计算血浆中的CGA 浓度。对于代谢物由于没有标准用来比较，浓度的变化只能通过峰面积比的变化来反映。

2.3.1 禁食和非禁食状态下CGA 的药代动力学研究图3为大鼠口服CGA 后的血浆CGA 浓度-时间关系。药代动力学数据如表4 所示，在FT 组和NF 组中，血浆中CGA 的最大浓度均出现在口服后的0.5 h，这与Choi 等[24]的结果一致，表明CGA 口服后在胃和小肠被迅速吸收。大量研究也表明，部分天然多酚和黄酮类物质在口服后迅速达到血浆浓度的最大值，例如：二氢杨梅素（30 min）[25]和儿茶素（60 min）[26]。FT1、FT2和FT3组的CGA 最大血浆浓度（Cmax）为（47.56±7.75），（118.21±12.18），（196.74±27.70）ng/mL这比NF1、NF2和NF3组分别高9，22.50，26.72 ng/mL。药物时间曲线下的面积（AUC）是评价药物吸收程度的一个重要指标，FT组AUC（0-t）分别为（117.86±12.11），（315.05±44.18），（478.75±28.43）（ng·h）/mL，而3个剂量NF组AUC（0-t）相较于FT组分别降低了17.02%、19.71%和22.26%，这可能的原因是非禁食状态下，大鼠体内食物减少了CGA 与胃肠吸收部位的接触面积以及食物中一些营养物质与CGA 相互作用影响其吸收而导致的。Sakuma 等[27]也指出，药物与残留在胃部的食物成分相互作用和竞争，这使得它们在非禁食状态下口服后的生物利用率较低。此外，非禁食状态下由于食物在胃和肠内粘附作用，这使得NF 组血浆中CGA 的消除半衰期（t1/2）比FT 组更长：低剂量组、中剂量和高剂量组分别延长了1.21，0.65，0.41 h，平均驻留时间[MRT（0-∞）]的差异（FT 组比NF 组分别缩短了1.71，0.90，0.22 h）也证实了这一点。

图3 禁食和非禁食条件下大鼠口服CGA后的血浆浓度时间曲线Fig.3 Plasma concentration-time curves of rats in FT group and NF states after oral administration of CGA

表4 禁食和非禁食状态下大鼠口服CGA后的药代动力学参数（n=6）Tab.4 Pharmacokinetic parameters of rats in FT and NF statesafter oral administration of CGA

2.3.2 DHCA、CGA-Methyl、CGA-Glu 和CA-Glu 药代动力学研究CGA 被吸收后，以游离态和代谢物的形式存在于体内[28]，因此，本研究继续分析超过定量限的活性代谢物（DHCA、CGA-Methyl、CA-Glu 和CGA-Glu）在体内的生物利用，由于没有标准品作比对，将其与芦丁（IS）的峰面积比作为研究对象，分析它们在体内的浓度变化。图4 中A-D 分别为血浆中DHCA、CGA-Methyl、CA-Glu 和CGA-Glu 的浓度随时间变化趋势图。这些代谢物能较早的检测到并在0.5～2 h达到最大血浆浓度，这也表明CGA 吸收后能在体内被快速代谢。由图4A可知，FT组和NF组大鼠口服CGA后DHCA分别在30 min和1 h时达到最大浓度，不同的是，在3个剂量组中，NF大鼠的最大血浆浓度均高于FT大鼠。DHCA 被认为是CGA 的主要微生物代谢产物[14]，因此这可能是非禁食状态下更加活跃的肠道微生物代谢更多CGA 所导致的。在图4B中，CGA-Methyl血浆浓度的变化与CGA基本一致，口服后血浆浓度迅速上升，FT组和NF组大鼠在1 h和2 h 达到最大浓度，FT1组中无显著差异，FT2和FT3组的最大血浆浓度显著高于NF2和NF3组。血浆中CA-Glu 随时间变化的趋势见图4 C，CA-Glu 的血浆浓度在口服后1～2 h 上升到最大值，在低剂量组中，NF 组CA-Glu 最大血浆浓度略高于FT 组，而在中、高剂量组中，FT 组显著高于NF 组，当CA-Glu 下降到一定浓度后，CA-Glu 在血浆中的代谢速度变得缓慢，这可能是由于CA-Glu 异构体的存在，而一些异构化的CA-Glu 代谢速率较慢[29]。CGA-Glu 是CGA 的葡萄糖醛酸共轭物，由于其结合不稳定，使其在血浆中的浓度较低，仅在100 mg/kg 组中被定量，浓度时间曲线见图4D。4 个CGA 代谢物在血浆中浓度变化与CGA 基本一致，由于CGA 在体内代谢迅速，代谢物能在较早的时间出现，随着CGA 浓度上升而上升。除DHCA 在NF 组的最大血浆浓度高于FT 组外，其它代谢物FT 组的最大血浆浓度均高于NF 组，从4 个代谢物峰面积与内标峰面积比来看，DHCA浓度最大，CA-Glu、CGA-Methyl其次，CGA-Glu最小。

图4 禁食和非禁食状态下大鼠口服CGA后血浆中代谢物浓度的时间曲线Fig.4 Time profiles of metabolite concentrations in the blood of rats following CGA infusion in FT and NF states

3 结论与讨论

CGA是植物有氧呼吸过程中通过莽草酸途径产生的一种多酚类化合物[1-2]，具有良好的生物学功能，包括清热、解毒、抗炎和抗菌等[7-8]，是许多中草药和草药复方制剂品质的主要评价指标之一。

多酚类物质和黄酮类物质主要在肠道中吸收和代谢[30]，剩余部分进入结肠被微生物分解或被排出体外，吸收的物质在肝中被进一步硫酸化/葡萄糖醛酸化、甲基化和氢化等[31-32]，代谢物经血液循环系统运输进入各目标组织，本研究对禁食和非禁食状态下大鼠口服CGA后的血浆中原药和代谢物进行分析，鉴定出CGA 经过水解、甲基化和葡萄糖醛酸化/硫酸化等主要代谢过程产生的代谢产物及在两种生理状态下的不同。CGA的许多代谢产物被发现具有生物活性，FA具有心脏调节功能[33]、FA和CA的葡萄糖醛酸化合物和硫酸化合物依然具有强大的抗氧化能力[34-35]、DHCA也被发现具有抗癌作用[14]。因此，在讨论CGA 的口服利用时，这些活性代谢成分也应该被关注。使用含2%乙酸的甲醇作为血浆蛋白质沉淀剂，建立UPLC-QQQ-MS 同时定量血浆中CGA 及其代谢物的检测方法，并使用该方法进行禁食和非禁食状态下大鼠口服CGA 后血浆中的CGA 及其主要代谢产物的生物利用度分析，与禁食大鼠相比非禁食状态下大鼠口服CGA 后，食物对CGA 吸收有阻碍作用，但会延长CGA 在体内驻留时间。从4 个代谢物峰面积与内标峰面积比来看，DHCA 浓度最大，CA-Glu、CGA-Methyl 其次，CGA-Glu 最小。CA-Glu、CGAMethyl 和CGA-Glu 浓度随时间变化趋势与CGA 基本一致，只有非禁食状态下血浆中DHCA 的含量高于禁食状态。研究结果可为提高CGA的口服生物利用度提供可靠的参考。

致谢：江西省现代农业产业技术体系项目（JXARS-3）和江西农业大学大学生创新创业项目（2021104100032）同时对本研究给予了资助，谨致谢意！