电针对脑梗死大鼠脑组织中BDNF/TrkB/PI3K信号通路的影响*

王琮民，闫纪琳，李海涛，牛丽辉，王敏，苗玲

（1.河北工程大学附属医院，河北 邯郸 056000；2.河北工程大学医学院，河北 邯郸 056000；3.邯郸市中心医院，河北 邯郸 056000）

急性脑梗死属于神经内科常见疾病，临床症状主要为偏瘫，是一类致死率、致残率、复发率极高的心脑血管疾病[1]。该病发病原因主要为脑部供血不足，造成脑组织缺血、缺氧性坏死，最终导致神经功能受损[2]。目前治疗脑梗死的方法主要是服用药物，如他汀类、阿司匹林等，但是治疗效果不佳[3]。而随着我国老龄人口不断增加，中老年人对生活的质量有了更高的要求，对心脑血管疾病治疗也更为重视，因此迫切需要简单、有效的方法治疗急性脑梗死。针灸作为传统康复治疗手段，操作简单，在治疗急性脑梗死中已经得到了认可，但大部分文献报道仅仅局限于观察临床疗效方面，对具体的作用机制鲜有报道[4]。而脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）/酪氨酸激酶（Tyrosine kinase，TrkB）/磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信号通路作为一种常见的信号通路，在治疗脑梗死方面受到很多学者的关注。因此，本研究通过改良线栓法建立脑梗死大鼠模型，从BDNF/TrkB/PI3K信号通路方面探索电针对脑梗死大鼠的治疗效果，以期为电针治疗脑梗死提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～7周龄雄性SPF级SD大鼠85只，体质量210～230 g，购自北京脑科学与类脑研究中心，动物生产许可证号：SCXK（京）2021-0005。所有大鼠均饲养于温度22 ℃、湿度55%的标准环境中，自由进食进水。使用实验动物遵循国家《实验动物管理条例》，并经动物伦理委员会批准通过。

1.2 药物与试剂 白细胞介素-8（Interleukin-8，IL-8）ELISA试剂盒（批号：ml037351）、肿瘤坏死因子-ɑ（tumour necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ）ELISA试剂盒（批号：ml002859）、白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）ELISA试剂盒（批号：ml064292）均购自上海酶联生物科技有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色液（批号：DK0005）购自北京雷根生物技术有限公司；兔抗BDNF抗体（批号：ab108319）、兔抗TrkB抗体（批号：ab187041）、p-PI3K抗体（批号：ab278545）、PI3K抗体（批号：ab32089）、蛋白激酶B抗体（protein kinase B，AKT）（批号：ab81283）、p-AKT抗体（批号：ab8805）均购自abcam公司；BDNF/TrkB通路抑制剂-K252a（批号：HY-N6732）购自美国MCE公司。

1.3 主要仪器 ZFM-800光学显微镜（上海正晞仪器设备有限公司）；Bio-Rad iMark酶标仪（上海京工实业有限公司）；XS-998B06低频脉冲电针治疗仪（上海聚慕医疗器械有限公司）。

1.4 造模与分组 参照张芳等[5]建立急性脑梗死大鼠模型的方法造模，操作过程如下：随机选取70只实验大鼠术前1天禁水、禁食，经腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉大鼠，仰卧位固定于操作台上，对颈部皮肤消毒，切开大鼠颈部，分离皮下组织，依次分离颈部总动脉，颈内、外动脉，近心端结扎颈外动脉，尼龙线（3 mm）结扎右侧颈总动脉，阻断血流，于颈内动脉根部位固定线栓，观察无出血现象即可缝合伤口并进行伤口清洁消毒。大鼠苏醒后，观察大鼠状况，如出现右眼睑下垂，瞳孔变小等霍纳综合征；运动时向左侧转圈；提尾时左侧前肢内收屈曲等症状，说明大鼠模型构建成功[6]。共有60只大鼠符合上述造模标准，4只大鼠死亡，6只大鼠造模失败，造模成功率为86%。将造模成功的大鼠随机分为模型组、电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组，每组15只。剩余15只大鼠作为假手术组，除不结扎外，其余操作与造模大鼠相同。

1.5 干预方法 抑制剂组、电针+抑制剂组大鼠经右侧脑室注射K252a，10 μg/kg[7]；假手术组、模型组、电针组大鼠注射等体积的生理盐水，1次/d，连续干预7 d。电针组、电针+抑制剂组对大鼠百会、风府、心俞、内关进行电针干预，电针干预方法参照大鼠解剖结构及《实验针灸学》[8]确认大鼠百会、风府、心俞、内关的定位。百会与风府为一组，患侧内关与心俞为一组，其中百会、内关接负极，风府、心俞接正极；将各组大鼠均置于操作台上并用皮筋固定在鼠板上，其中电针组、电针+抑制剂组大鼠进行电针干预，电针治疗仪连接0.3 mm×25 mm毫针，直刺4～6 mm，参数选择：频率为10 Hz的疏密波，留针时间为30 min。1次/d，连续治疗7 d。

1.6 观察指标

1.6.1 神经功能缺损评估 参照Longa[9]的评分标准，对治疗后的大鼠进行神经功能缺损评估：无神经功能损伤症状计0分；不能完全伸展左侧前爪或后爪计1分；行走时向左侧转圈计2分；行走时向左侧倾倒计3分；无法自发行走，丧失意识计4分。

1.6.2 样本采集及处理 神经功能缺损评估完成后，每组随机选取10只大鼠，采用戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉大鼠，眼球取血，离心取上清液，用于ELISA检测血清中炎症因子水平；处死大鼠，取出脑组织，置于-80 ℃冰箱中保存，用于后续Western blotting检测；将剩下各组5只大鼠处死，取出脑组织置于-20 ℃冰箱中保存，用于TTC染色。

1.6.3 大鼠脑梗死面积 取上述“1.6.2”中置于-20 ℃冰箱中的脑组织，从额极开始，每间隔2 mm进行一次冠状面切片，之后放入培养皿中培养，避光条件下进行TTC染色，37 ℃孵育25 min，10%多聚甲醛溶液中固定，拍照并用图像分析系统检测大鼠脑梗死面积，脑梗死面积比=（缺血部分面积/切片面积）×100%。

1.6.4 血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2水平 取上述“1.6.2”中血清样本，检测大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2水平，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.6.5 大鼠脑组织中BDNF/TrkB/PI3K通路相关蛋白表达 取上述“1.6.2”中适量脑组织，加入细胞裂解液，4 ℃、12 000 r/min离心10 min提取总蛋白，BAC蛋白定量试剂盒定量分析、SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳、转膜、封闭，加入稀释后的BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、AKT、PI3K一抗（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000），4 ℃恒温箱过夜；TBST洗涤、加入二抗室温孵育1 h，ECL试剂盒显色、凝胶成像仪拍照，分析灰度值，计算各组大鼠BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT蛋白表达水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以“均数±标准差”（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，电针组大鼠神经功能缺损评分明显降低（P＜0.05），抑制剂组大鼠神经功能缺损评分明显升高（P＜0.05）；电针+抑制剂组大鼠神经功能缺损评分与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；电针+抑制剂组大鼠神经功能缺损评分明显高于电针组，而明显低于抑制剂组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较（，分）

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较（，分）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与电针组比较，cP＜0.05；与抑制剂组比较，dP＜0.05

2.2 各组大鼠脑梗死面积比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死面积明显增大（P＜0.05）；与模型组比较，电针组大鼠脑梗死面积明显减小（P＜0.05），抑制剂组大鼠脑梗死面积明显增大（P＜0.05）；电针+抑制剂组大鼠脑梗死面积与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；电针+抑制剂组大鼠脑梗死面积明显大于电针组，而明显小于抑制剂组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见图1、表2）

表2 各组大鼠脑梗死面积比比较（，%）

表2 各组大鼠脑梗死面积比比较（，%）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与电针组比较，cP＜0.05；与抑制剂组比较，dP＜0.05

2.3 各组大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，电针组大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量均明显降低（P＜0.05），抑制剂组大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量均明显升高（P＜0.05）；电针+抑制剂组大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；电针+抑制剂组大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2含量明显高于电针组，而明显低于抑制剂组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2 水平比较（，ng/mL）

表3 各组大鼠血清IL-8、TNF-ɑ、IL-2 水平比较（，ng/mL）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与电针组比较，cP＜0.05；与抑制剂组比较，dP＜0.05

2.4 各组大鼠脑组织中BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT蛋白表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中BDNF、TrkB蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，电针组大鼠脑组织中BDNF、TrkB蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明显升高（P＜0.05），抑制剂组大鼠脑组织中BDNF、TrkB蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明显降低（P＜0.05）；电针+抑制剂组大鼠脑组织中BDNF、TrkB蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；电针+抑制剂组大鼠脑组织中BDNF、TrkB蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT明显低于电针组，而明显高于抑制剂组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（见图2、表4）

表4 各组大鼠脑组织中BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT 蛋白相对表达量比较（）

表4 各组大鼠脑组织中BDNF、TrkB、p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT 蛋白相对表达量比较（）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与电针组比较，cP＜0.05；与抑制剂组比较，dP＜0.05

3 讨 论

脑梗死主要是由于脑部血液流通受阻，致使大脑缺血、缺氧、脑细胞坏死，与吸烟、年龄、高尿酸血症及动脉粥样硬化等危险因素密切相关[10]。该病发病快，发病率、致死率及致残率均较高。患者会出现认知、语言、运动等方面障碍，严重影响了患者的生理、心理和日常生活。脑梗死须进行长期康复治疗[11-12]，其中溶栓、抗凝、护脑等是常见的治疗手段，但治疗周期较长，加重了患者的心理及经济负担，容易对治疗失去信心。因此开发新的脑梗死治疗手段已成为心脑血管领域的研究重点。本研究通过改良线栓法建立脑梗死大鼠模型，发现模型大鼠出现右眼霍纳综合征、向左侧转圈、左侧前肢内收屈曲等症状，这表明造模成功，可进行下一步的研究。

中医学又称脑梗死为“中风”，造成该疾病的原因主要与气血运行受阻，清窍失养有关[13]。针灸作为非药物治疗手段，可以通过刺激穴位达到通经活络、活血化瘀的目的，从而改善神经功能缺损[14-15]。百会穴可通关开窍、补神益智、启闭醒神；心俞为调理“心”脏要穴；风府可调动五脏六腑之精气；内关使血、心、脉及神相互联系，可起到宁心安神之效。百会配风府，辅以心俞、内关，可醒神开窍、调督通络。姚文超等[16]研究表明电针百会、风府、心俞、内关联合康复训练，可有效促进右侧大脑中动脉缺血模型大鼠血管新生，恢复神经功能；王珊等[17]研究表明电针可以缓解脑缺血再灌注大鼠的脑损伤，提高大鼠运动能力。本研究选择对缺血性疾病具有较好疗效的百会、风府、内关、心俞进行电针干预，结果发现，与模型组比较，电针组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死面积均明显降低。这表明电针治疗在一定程度上可以改善脑梗死造成的不良症状，但具体作用机制有待进一步探索。

BNDF作为一种神经营养因子，在脑梗死发生后，有助于缩小脑组织梗死面积及减轻脑损伤，其生物学功能主要通过受体TrkB发挥作用。BNDF与TrkB结合形成二聚体的同时会诱导TrkB磷酸化，激活下游通路，保护脑组织，促进神经元可塑性[18]。PI3K是一种可与营养因子结合的生长因子，AKT是一种特异性蛋白激酶，一旦受到生长因子、胰岛素等影响，便会激活PI3K/AKT信号通路，参与细胞的生长、增殖、营养代谢等过程。PI3K/AKT信号通路作为BNDF/TrkB下游通路之一，在保护脑组织和抗细胞缺血缺氧过程中起着重要作用[19]。本研究发现，与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中BDNF、TrkB蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明显降低，表明抑制BDNF/TrkB/PI3K通路可能是造成大鼠脑损伤的原因。电针组大鼠脑组织中BDNF、TrkB蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明显升高，表明电针改善脑梗死造成的不良症状，可能与激活BDNF/TrkB/PI3K通路有关。

BDNF/TrkB/PI3K信号通路在一定程度上与炎症因子释放有密切关系。线粒体损伤、炎症反应、氧化应激、激活凋亡因子等过程均可导致脑梗死的发生发展，其中炎症反应在脑梗死中起着关键作用。肿瘤坏死因子、干扰素、白细胞介素等炎症因子是炎症免疫中的基本介质，其中肿瘤坏死因子和白细胞介素相互拮抗，在疾病治疗中共同发挥抑制炎症作用[20]。本实验进一步使用BDNF/TrkB/PI3K通路抑制剂K252a干预大鼠，结果发现，与电针组比较，电针+抑制剂组大鼠血清IL-8、IL-2、TNF-ɑ含量均显著升高，大鼠脑组织中BDNF、TrkB蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT均明显降低，提示BDNF/TrkB/PI3K通路抑制剂可逆转电针对大鼠脑梗死的缓解作用。这进一步揭示了电针可改善脑梗死造成的不良症状，减轻炎症反应，与激活BDNF/TrkB/PI3K信号通路。

综上所述，电针治疗可以有效地改善脑梗死大鼠脑损伤，减轻炎症反应，其机制可能与激活BDNF/TrkB/PI3K信号通路有关。电针治疗脑梗死的作用机制可能还受其他信号通路的影响，还有待进一步研究。