黄芩苷口腔贴片的制备及质量初步评价*

杨 东，毕建云，刘文静

（1.潍坊市益都中心医院，山东 潍坊 262500；2.山东中医药大学，山东 济南 250355）

黄芩苷为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根经加工提取的黄酮类化合物，为淡黄色至棕黄色的粉末，味淡、微苦。药理研究结果显示黄芩苷水解可产生黄芩素和葡萄糖醛酸，具有抗炎、降血压、调节免疫等多种药理作用[1-3]，现常用剂型为片剂和胶囊剂。但黄芩苷水溶性差、口服吸收不佳，易在胃肠道降解而降低口服给药生物利用度，从而限制药性发挥[4]。故笔者将黄芩苷制备成口腔贴片粘贴于口腔，使其经黏膜吸收后起局部或全身作用，从而有效避免药物首过效应和口服给药导致的患者服药依从性降低，同时使药物直达患处，稳定药效和药物释放速率，延长药物的释放和作用时间。本研究采用BOX-Behnken-响应面法（BBDRSM法）优选黄芩苷口腔贴片的最佳成型工艺，并通过片重差异、薄层鉴别和含量测定对黄芩苷口腔贴片进行初步质量评价，为其质量标准的制定提供依据。

1 材料与试剂

1.1 仪器 LC-16型高效液相色谱仪，检测器为SPD-16紫外可见检测器，工作站为LC-Solution（日本岛津）；FA2004B型电子天平（上海天美天平仪器有限公司）；HH-2型数显恒温水浴锅（江苏东鹏仪器制造有限公司）；PL-S20型数码超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）；ZP-8型压片机（上海天和制药机械有限公司）；UV-9600型紫外灯分析仪（杭州齐威仪器有限公司）。

1.2 药物与试剂 黄芩（批号：20031001）购于山东省药材公司，供提取黄芩苷用；黄芩苷（批号：MUST-13112909）购于上海经科化学科技有限公司，供含量测定用；辅料：羟丙甲基纤维素、卡波姆、甘露醇、微晶纤维素均购于陕西正一药用辅料有限公司；试剂：硬脂酸镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、薄荷脑、淀粉、盐酸、氢氧化钠、乙醇、醋酸、甲醇、磷酸均购自济南启光科贸有限公司，甲醇、磷酸均为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；黄芩苷口腔贴片3批（批号：20210409，20210411，20210413），由山东中医药大学药学实验室研制。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷提取物的制备 按照碱溶酸沉原理，遵循2020年版《中华人民共和国药典》[5]步骤制备黄芩苷提取物。

2.2 考察指标的确立

2.2.1 外观性状 本实验成品为淡黄色口腔贴片，外表光滑，干燥无黏性，遇唾液黏附性良好。

2.2.2 pH值 取本实验成品5片均匀分散于10 mL水中使其充分溶胀并超声混匀，测定pH值，为6～8。

2.2.3 体外黏附时间的测定 取2.38 g Na2HPO4、0.19 g KH2PO4、0.8 g NaCl溶于1 000 mL蒸馏水中配制人工唾液，并调节pH值至7.0备用。用人工唾液润湿药片底部，使药片自然黏附于小烧杯壁上的中间部分，加入足量人工唾液没过药片，37 ℃水浴保温，记录药片脱落时间，考虑两餐间隔时间，药品脱落时间应不少于3.5 h[6]。

2.2.4 黏附力的测定 首先配制1 000 mL人工唾液备用。取新鲜的鸡蛋壳膜置于人工唾液中浸泡，使充分浸润后，剪取适当面积大小（应大于所制备口腔贴片面积）粘贴于玻片。用人工睡液润湿口腔贴片释药面并迅速覆盖玻片，给予一定外力使图1中的“3”和“4”紧密接触，放缓输液速度，玻片脱落时图1中“4”和“5”的总质量即药片黏附力，每个处方平行测定5次[7]。（见图1）

2.2.5 体外释药性能 采用琼脂基质测定法测定所制备口腔贴片的释药性能。取9 g NaCl、0.12 g KCl、0.24 g CaCl2、0.2 g NaHCO3溶于1 000 mL蒸馏水中配制林格液，并调节pH值至7.0，备用。取200 mL林格液，加入1.4 g琼脂粉，煮沸溶解，趁热倾入试管，垂直放至冷凝。将制备的口腔贴片释药面用少许人工唾液润湿后垂直放入，使其自然黏附于试管内的琼脂基质表面，37 ℃水浴恒温，黄芩苷口腔贴片本身呈淡黄色，故可直接记录0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h时的呈色区高度。以时间为横坐标，扩散距离的平方为纵坐标拟合一直线，直线的斜率即扩散系数。扩散系数大者释放性能优[8]。

2.3 黄芩苷口腔贴片的制备 将黄芩苷提取物充分研磨备用。综合现有文献记载黄芩常用处方量及现存口腔贴片制备工艺中常用辅料及其配比，初步确定黄芩苷口腔贴片所用辅料及其处方量为每片含14 mg黄芩苷提取物、24 mg羟丙甲基纤维素、16 mg卡波姆、6 mg甘露醇、14 mg微晶纤维素、4 mg硬脂酸镁。精密称取后按照等量递加的原则依次加入原料药和辅料并充分混合均匀，根据依从性需要，可加入微量薄荷脑。调节压片机使得片厚度为0.9 mm，采用6 mm冲模进行粉末直接压片，即得黄芩苷口腔贴片[9-12]。

2.4 星点设计-效应面法优选黄芩苷口腔贴片的最佳成型工艺[13-17]

2.4.1 因素水平表的建立 本实验所用辅料较少，故选择对黄芩苷口腔贴片成型工艺影响显著的3个因素，即基质羟丙甲基纤维素用量（A）、卡波姆用量（B）、微晶纤维素用量（C）为考察因素，以黏附力（R1）和扩散系数（R2）为评价指标，采用BBD-RSM法设计三因素三水平优选成型工艺，根据“2.3”项下实验结果，确定各因素水平的极值。（见表1）

表1 Box-Behnken 响应面实验设计因素及水平

2.4.2 星点设计实验结果及分析 将上述各因素水平采用Design-Expert 8.0.6.1软件随机安排实验，实验结果见表2。

表2 Box-Behnken 响应面实验设计与结果

2.4.3 模型拟合 根据表2的数据结果，通过Design-Expert 8.0.6.1软件得到黏附力（R1）和扩散系数（R2）的二次多项式回归模型：R1=7.00+0.93A+0.54B+0.61C-0.13AB+0.25AC-1.15BC-1.46A2+0.75B2+1.10C2；R2=8.52-0.49A-0.13B-0.19C-1.24AB+0.17AC+0.049BC-0.47A2+0.16B2+1.05C2。

2.4.4 方差分析 为检验“2.4.3”中二次多项式回归模型的有效性及“2.4.1”所述因素对黏附力和释放性能的影响程度，对回归方程进行方差分析。

由表3可知，总模型方程极显著（P＜0.01），说明该模型拟合度良好，较好地反映了黏附力与羟丙甲基纤维素用量、卡波姆用量和微晶纤维素用量之间的关系；二项式回归方程失拟项检验不显著（P=0.076 9＞0.05），说明在黏附力的测定试验中误差较小，回归方程的代表性较好，能准确地预测黄芩苷口腔贴片的黏附力情况。

表3 黏附力二次多项式模型的方差分析

表4可知，以扩散系数为响应值的二次回归模型（P＜0.01），达到显著水平，说明该模型拟合程度较高，扩散系数测定实验误差较小；失拟项检验不显著（P=0.926 7＞0.05），说明实验结果所受干扰较小，故该模型可用来对黄芩苷口腔贴片的释放性能进行分析和预测。

表4 扩散系数二次多项式模型的方差分析

对回归方程各项方差进行进一步检验可看出，羟丙甲基纤维素用量P均小于0.01，说明这个因素对黄芩苷口腔贴片黏附力和扩散系数的影响都极显著；羟丙甲基纤维素用量和微晶纤维素用量二次项对黄芩苷口腔贴片黏附力和扩散系数的影响均达到极显著水平，交互项BC对黄芩苷口腔贴片黏附力极显著，交互项AB对黄芩苷口腔贴片扩散系数影响显著。综上，在所选的各因素水平范围内，羟丙甲基纤维素用量对黄芩苷口腔贴片最优处方的筛选影响最大。

2.4.5 工艺优化与预测 应用Design-Expert 8.0.6.1软件，根据二次多项式回归方程绘制各响应值与因素的三维响应面图。由图2的响应面图可知3个影响因素对黏附力和扩散系数的影响及变化趋势。此实验在所选范围内最佳落点在实验考察的区域内，从而确定最佳制备工艺为：羟丙甲基纤维素用量为26.53 mg，卡波姆用量为12 mg，微晶纤维素用量为16 mg，此时黄芩苷口腔贴片理论黏附力为10.31 g，理论扩散系数为10.02。（见图2～3）

2.4.6 口腔贴片成型工艺的处方优化及验证 根据“2.4.5”最佳条件制备3批黄芩苷口腔贴片，并对实验样品进行初步质量检查，即分别平行测定其黏附力和扩散系数3次。预测值与真实值偏差均小于10%，表明该回归模型具有可靠性，所建立的数学模型具有良好的预测性，筛选出的口腔贴片符合《中华人民共和国药典》的规定，所优选的最佳成型工艺合理可行、稳定可靠。（见表5）

表5 验证实验结果

2.5 质量初步评价

2.5.1 片重均匀度 取按照最优处方制备的3批黄芩苷口腔贴片各20片，精密称定每一片的重量，为减小操作过程误差，故用镊子夹取口腔贴片进行精密称定。《中华人民共和国药典》规定0.3 g以下片剂重量限度为±7.5%，所制备3批样品重量差异范围为-5.26%～5.50%，均未超出重量差异限度，表明黄芩苷口腔贴片重量差异合格。

2.5.2 薄层鉴别[18]

2.5.2.1 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL的溶液。

2.5.2.2 供试品溶液的制备 取3批样品各140 mg，置具塞锥形瓶中，用20 mL甲醇超声处理30 min，放冷滤过，取上清液，定容至25 mL。

2.5.2.3 阴性对照溶液的制备 按“2.4.5”所述最佳条件制成不含黄芩苷提取物的阴性口腔贴片，按“2.5.2.2”项方法制成阴性对照溶液。

2.5.2.4 TLC实验及结果 照2020年版《中华人民共和国药典》黄芩苷提取物薄层鉴别法进行检视，谱图结果见图4，供试品与对照品在相应位置显示相同颜色的荧光斑点，阴性对照在相应位置无斑点，表明本实验所用鉴别方法具良好重现性、专属性和层析效果。

2.5.3 含量测定[19-20]

2.5.3.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；填充剂：ODS；流动相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.5.3.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品3 mg，置100 mL量瓶加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。

2.5.3.3 供试品溶液的制备 精密称取3批样品粉末各12 mg，用15 mL甲醇超声0.5 h，放冷滤过，取上清液置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀过0.45 μm微孔滤膜，每一批样品做3组供试品。

2.5.3.4 阴性样品溶液的制备 按“2.4.5”最佳条件制得不含黄芩苷提取物的阴性样品，按“2.5.3.3”项下方法制成阴性样品溶液。

2.5.3.5 专属性试验 分别精密吸取上述各溶液10 μL，按“2.5.3.1”项下色谱条件测定，色谱图结果见图5。

2.5.3.6 线性关系考察 精密吸取不同浓度的黄芩苷对照品10 μL，进样量（μg）分别为0.15、0.30、0.60、1.30、2.50，以进样量为横坐标，相应峰面积为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程为Y=2 099 650.06X-8 767.62，相关系数（r）=0.999 8。（见图6）

2.5.3.7 精密度试验 在“2.5.3.1”项下色谱条件下，精密吸取黄芩苷对照品溶液，连续进样6次，RSD为1.53%，表明仪器精密度良好。

2.5.3.8 稳定性试验 精密吸取供试品溶液各10 μL，分别在0、4、8、12、24 h进行测定，RSD为1.81%，表明黄芩苷性质稳定。

2.5.3.9 重复性试验 取同一时间同批号原料制备的口腔贴片，按“2.5.3.3”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.5.3.1”项色谱条件测定，记录峰面积并计算含量，结果样品平均浓度为0.054 0mg/mL，RSD为1.55%，表明该样品及供试品制备方法可行。

2.5.3.10 加样回收率试验 分别称取成分含量已知的黄芩苷口腔贴片粉末约6 mg，分别加入等量对照品，。按“2.5.3.3”项制备供试品，按“2.5.3.1”项下方法测定，记录峰面积和含量，计算加样回收率，结果黄芩苷口腔贴片平均加样回收率为97.39%，RSD为1.43%。（见表6）

表6 加样回收率试验结果

2.5.3.11 样品含量测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL进行测定，计算各批样品中每片黄芩苷的平均含量，最终确定每片黄芩苷口腔贴片中黄芩苷的含量不得少于8 mg。（见表7）

表7 含量测定结果

2.5.4 黏附力和释放性能的测定 按照“2.4.5”项下最优处方制备3批黄芩苷口腔贴片，测定黏附力不得小于10 g，扩散系数不得小于10。由表5可知，该制剂黏附力与扩散系数均大于10，且偏差均在规定值之内，可初步确定最终制备的黄芩苷口腔贴片具有良好的黏附力和释放性能。

3 讨 论

本实验先采用玉米淀粉和微晶纤维素作为填充剂，但在实验过程中发现所得片剂易碎且周身伴有粉末，可能是玉米淀粉成片粉末性严重，故弃用玉米淀粉。虽弃用玉米淀粉，但微晶纤维素用量不可增量过多，仍须控制在合适范围内，因其为疏水性辅料，用量过多会影响溶出扩散。此时，原料药黄芩苷、微晶纤维素、矫味剂甘露醇均可起到填充剂的作用。本实验所得黄芩苷口腔贴片外表面光滑，入口略苦，但矫味剂甘露醇不宜过多，为改善口感，加入微量薄荷脑起消炎清凉作用。然而，成片后易碎，黏附力下降，后采用增加羟丙甲基纤维素和卡波姆增强黏附性，成效不佳，故排除黏附剂用量不足的原因。因微晶纤维素吸水性强，薄荷脑为油性物质，成片松软疑为含水量不足，故先用淀粉适当吸附薄荷脑，将两者混合物取微量加入药片，并将所称辅料混合均匀后静置一晚后再进行压片，效果较好。测定黏附力时所采用的鸡蛋壳膜，用双面胶、液体胶黏附于贴片时，遇水或人工唾液极易脱落。故将浸泡在人工唾液中有一定时间的鸡蛋壳膜，内层滑面自然黏附于玻片，待其自然风干，即可使用。测定黏附力，须将药片两面黏附于玻片和鸡蛋壳膜，注意不可马上测定，须静置15～20 min。时间过短，黏附不当，药片易滑落；时间过长，潮湿药片风干中部易裂片且两面不易脱落。

质量评价方面采用了片重均匀度、薄层色谱鉴别、高效液相含量测定、黏附力及扩散系数的测定，可以对黄芩苷口腔贴片的质量进行初步评价。后期可采用溶出扩散仪对其溶出度进行测定，并对该制剂的滞留时间、口腔吸收情况进行考察，对其质量进行更深一步的考察，以期为新药的开发奠定基础。