中药外治1 685例腕管综合征用药规律和作用机制研究*

赵 伟，李小波，唐大伟

（成都市双流区第一人民医院，四川 成都 610200）

腕管综合征（carpal tunnel syndrome，CTS）是由于多种因素导致腕管内正中神经损伤，出现桡侧手指麻木、刺痛、感觉异常、功能障碍等症状的最常见周围神经卡压性疾病[1]。欧洲流行病学研究[2]发现，CTS发病率为5%，女性高于男性，任何年龄阶段均可发病，45～54岁为发病高峰。近年来随着科技的发展、各种电子产品应用程度的大大提升，CTS的发病率日益升高，且患病人群趋于年轻化，严重影响患者身心健康[3]。目前CTS的主要治疗手段为手术治疗和非手术治疗，轻中度CTS以非手术治疗为主。中医药以其良好疗效而具有独特的优势，其中中药外治法以临床疗效好、不良反应少、安全性高等优势广泛应用于临床。

由于本病的中医证型尚未统一，临床上治疗的药物也不尽相同，故本研究旨在通过分析中药外治CTS的用药规律，并通过网络药理学方法分析其可能的作用机制，为临床治疗CTS提供依据。

1 资料与方法

1.1 纳入标准（1）明确诊断为CTS；（2）纳入文献为临床研究类，暂不考虑是否为随机对照试验；（3）文献与中药外治CTS相关；（4）中药外治方药组成完整，不能出现“等”字；（5）经中药外治后患者临床症状和相关指标好转。

1.2 排除标准（1）综述、理论、病案报道、基础实验等类型文献；（2）方药不完整或者无具体方药的研究；（3）口服中药或者非复方研究。

1.3 数据来源 以“中药”“腕管综合征”为主题词或关键词检索中国知网、万方、维普和PubMed数据库，检索时间从各数据库建库至2021年4月。此外，二次检索综述类和纳入研究的参考文献。

1.4 数据录入和预处理 首先使用Excel表格录入作者、病例数、处方用药等信息，规范处方药名后运用中医传承辅助平台（V3.0）模板录入处方信息，一人负责信息录入，另一人负责信息核对。以2015年版《中华人民共和国药典》一部[4]为标准规范所有药物名称，例如：醋乳香、制乳香统一为乳香，制川乌、川乌统一为川乌。

1.5 数据分析 通过中国中医科学院提供的中医传承辅助平台V3.0进行数据分析。此软件包括数据上传与数据下载部分，可进行统计分析、方剂分析、舌脉、穴位等数据分析。本研究通过“数据分析”项下的“统计分析”和“方剂分析”功能分析药物频数、四气、五味、归经、功效、关联规则和聚类分析等。

1.6 基于网络药理学分析核心处方治疗CTS的作用机制

1.6.1 核心处方的有效化学成分和作用靶点 通过TCMSP数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[5]获取核心处方各中药的化学成分，以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug likeness，DL）≥0.18为筛选条件获取各中药的有效成分[6]，同时检索文献数据库对药物成分进行补充和完善，并将得到的有效成分在TCMSP数据库收集相关靶点。随后利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org）[7]筛选作用于人类的蛋白靶点并转换成标准的基因名，获得核心药物的候选靶点。

1.6.2 预测CTS靶点 通过GeneCards（https://www.genecards.org）[8]及OMIM数据库（https://www.omim.org）[9]获得CTS靶点，其中将GeneCards数据库中的关联分数（Relevance score）设置为≥10。

1.6.3 构建PPI网络及可视化网络图 利用Venn在线数据库（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）[10]获得药物和疾病共同靶点，将共同靶点导入STRING在线数据库中获得PPI网络，并利用Cytoscape 3.8.1软件中cytoHubba插件得到PPI的关键靶点子网络，同时构建“药物有效成分-CTS-靶点”可视化网络图。

1.6.4 KEGG通路富集分析 通过R软件及其“ggplot2”“clusterProfiler”“enrichplot”等安装包对共同靶点进行KEGG通路富集分析。

2 结 果

2.1 文献筛选结果 初步检索出247篇相关文献，其中中国知网84篇，万方数据库58篇，维普数据库49篇，PubMed56篇，剔重后获得146篇文献。通过进一步阅读、筛选，剔除不符合纳入标准的文献51篇，最终筛选出66篇文献。其中1项研究涉及2个处方，所以最终纳入67首处方，涉及1 658例CTS患者。（见图1）

2.2 中药外治方法统计 本研究纳入的66项研究中药外治方法包括中药熏洗、中药外敷、中药离子导入和中药蜡疗。其中以中药熏洗和中药外敷为主，二者所占比例高达96.96%（64/66），具体分布见图2。

2.3 药物统计

2.3.1 药物频数 本研究所纳入的67首处方包含95味中药，累计出现频数为479次，平均频数为5次。频数＜5的中药有65味，占23.38%（112/479）；频数≥5的中药30味，占76.62%（367/479）。红花、桂枝、伸筋草、透骨草、威灵仙、川芎、海桐皮、当归等为使用频数排名靠前的药物。频数≥5的药物见表1。

表1 药物频数分布（频数≥5）

2.3.2 药物四气 95味中药四气频数累计出现428次，其中频数由高到低依次为温、平、寒、热、凉，性温、热、平占88.55%（379/428），寒、凉占11.45%（49/428）。（见图3）

2.3.3 药物五味 95味中药的五味频数累计出现715次，其中频数由高到低依次为辛、苦、甘、咸、酸，其中辛、苦、酸占93.70%（670/715），咸、酸占6.30%（45/715）。（见图4）

2.3.4 药物归经 95味中药涉及除小肠经之外的十一条归经，归经频数累计出现1 070次，频数靠前的归经为肝、脾、心、肾、膀胱等，其中肝、脾、心、肾、膀胱、肺经占91.12%（975/1 070）。（见表2）。

表2 药物归经分布

2.3.5 药物功效 中药功效分类参考高学敏主编新世纪全国高等中医药院校教材第一版《中药学》[11]。95味中药涉及17种功效分类，累计频数为426，其中活血化瘀类居于首位（134次），其次为祛风湿类、解表类、补虚类、清热类等。（见图5）

2.3.6 药物关联规则分析 本研究将支持度个数设置为20（支持度约为30%），置信度为0.7，得到11个二联高频药物组合，涉及8味中药。其中伸筋草-透骨草、红花-伸筋草、红花-桂枝等为排名靠前的药物组合。（见表3）将支持度个数设置为12（支持度约为20%），置信度为0.7，得到44个三联高频药物组合，涉及20味中药。其中红花-伸筋草-透骨草、红花-桂枝-伸筋草等为排名靠前的药物组合。（见表4）为更加直观展示高频数药物组合之间的关系，分别设置支持度为10%、20%、30%，置信度均为0.7，得到了药物关系网络图以反映高频药物治疗CTS的关系。（见图6～8）

表3 二联高频药物组合表（支持度30%，置信度0.7）

表4 三联高频药物组合表（支持度20%，置信度0.7）

2.3.7 药物聚类分析 聚类分析是对所选取的方剂数据进行聚类，通过无监督聚类算法，将聚类个数设定为3，即将67首处方分为3类。图中不同的颜色代表不同类别，不同颜色点数的多少代表方剂的数量多少，越靠近回归曲线，表示越与此类别的核心药物越接近。（见图9）第一类以桂枝、羌活、红花、胆南星、川乌为主的类似处方有12首，第二类以红花、川芎、伸筋草、桃仁、赤芍为主的类似处方有12首，第三类以透骨草、桂枝、威灵仙、伸筋草、红花为主的类似处方有43首。（见表5）

表5 无监督聚类核心组合（聚类个数为3）

2.4 基于网络药理学分析“透骨草-桂枝-威灵仙-伸筋草-红花”治疗CTS的作用机制

2.4.1 核心处方药物的有效化学成分和作用靶点 通过TCMSP数据库得到“透骨草-桂枝-威灵仙-伸筋草-红花”有效活性成分39个。其中透骨草3个，桂枝5个，威灵仙5个，伸筋草3个，红花18个，透骨草和红花共同成分2个，桂枝和伸筋草共同成分1个，威灵仙和红花共同成分1个，透骨草、桂枝、威灵仙和红花共同成分1个。（见表6）

表6 “透骨草-桂枝-威灵仙-伸筋草-红花”的有效活性成分

续表6：

2.4.2 获取CTS靶点 以“carpal tunnel syndrome”为检索词，从GeneCards数据库中得到相关靶点682个；以relevance score≥15为筛选条件，获得652个靶点；从OMIM数据库得到CTS相关靶点637个，筛重后获得疾病相关靶点1 267个。

2.4.3 构建共同靶点PPI网络图 利用Venn数据库将“透骨草-桂枝-威灵仙-伸筋草-红花”的109个药物靶点与1 267个CTS靶点取交集，以Venn图的形式得到33个共同靶点。（见图10）随后将33个共同靶点导入STRING数据库，设置物种为“homo sapiens”，medium confidence为0.4，得到共同靶点额PPI网络图，其中涉及33个节点，250条边。（见图11）

将STRING得到的“tsv.”格式文件导入Cytoscape 3.8.1软件，利用其cytoHubba插件的MCC分析法得到PPI网络关键靶点子网络。图中颜色越深表示靶点分数越高，越显著。关键靶点依次为ALB、CASP3、EGFR、MYC、ERBB2、IL6、VEGFA、FOS、CCND1、ESR1、CASP8、CASP9等。（见图12）

2.4.4 构建“药物成分-疾病-靶点”网络图 通过Cytoscape 3.8.1软件构建“药物成分-靶点-疾病”的可视化网络图。其中红色倒三角形代表药物有效成分，黄色圆形代表靶点，蓝色菱形代表疾病，灰色线条代表各节点之间的相互联系。（见图13）

2.4.5 KEGG功能富集分析 利用R软件的“ggplot2”“cluster－Profiler”“enrichplot”等安装包对33个共同靶点进行KEGG富集分析，得到了87条相关信号通路，排名靠前的信号通路主要为卡波西肉瘤相关性疱疹病毒感染、癌症中的蛋白多糖、人类巨细胞病毒感染、PI3K-AKT信号通路、铂耐药、直肠癌、乳腺癌、丙型肝炎病毒感染、EB病毒感染、MAPK信号通路等。（见图14）

3 讨 论

中医学将腕管综合征归属于“痹证”“筋伤”范畴，气滞血瘀、络脉不通是其主要病机，其病因主要分为内因和外因。外感风寒湿邪，或外伤、劳损等为外因；素体正气虚弱，腠理不固是其内因。外因侵袭腕部，素体亏虚，内外合邪，筋脉损伤，瘀血内阻，气血运行不畅而发病[12]。

中药熏洗和中药外敷是67首方剂治疗CTS的主要给药方式，二者均是通过局部用药使中药有效成分直接作用于患处发挥治疗效果。两者临床疗效显著，还可避免口服药物所引起的胃肠道反应和肝肾损害等不良反应。中药熏洗通过药力和热力相结合，可发挥活血化瘀、调达气血、消肿止痛等功效，从表皮筋肉到肌肉骨骼，逐层渗透，从而改善局部血循环[13]。中药外敷是目前临床上应用较多的中医外治方法之一。中药外敷是通过皮肤表层的毛囊孔、皮脂腺等细微通道直接吸收贴敷药物，可避免首过效应，具有持久稳定、使用方便优势[14]。中药外治法简单有效，安全性高，临床应用广泛。

本研究发现67首处方包含95味中药，其中红花、桂枝、伸筋草、透骨草、威灵仙等为频数排名前五的药物。红花，性味辛温，活血通经止痛；桂枝，性味辛温，入心经，温通经脉，助阳化气；伸筋草，辛苦温，可祛风除湿，舒筋活络；透骨草性温，味辛，归肝、肾经，能够祛风除湿，舒筋活血止痛，善治跌打损伤、瘀肿疼痛、骨节挛痹等；威灵仙通行十二经，其性走窜，祛风湿，通经络止痛，为筋骨痹痛之常用药。五者均属于性味辛温之品，辛能散能行，温可温阳散寒通脉。诸药合用外洗患处，可奏温经通脉、散寒除湿止痛之功。此结果与性味统计结果相一致，四气累计出现428次，五味累计出现715次，其中辛温居于首位。辛温之品通过外治之法，直达肌肤筋骨以驱散风寒湿之邪，此与CTS易外感风寒湿邪相一致。

关联规则是数据挖掘最常用部分之一，中医处方数据进行关联分析可发现高频数药对，其是对古今医家长期医疗实践的经验总结[15]。本研究通过关联规则分析发现，伸筋草-透骨草、红花-伸筋草、红花-桂枝、桂枝-伸筋草、红花-透骨草、透骨草-威灵仙等为排名靠前的二联高频药物组合，红花-伸筋草-透骨草，红花-桂枝-伸筋草等为排名靠前的三联高频药物组合，这些排名靠前的药物组合涉及中药为伸筋草、透骨草、红花、桂枝、威灵仙，此与高频数单药相一致。这些高频单药和药物组合是祛风湿类药、活血化瘀类药及解表药之间的组合，与中药外治CTS常见药物功效分类一致。“透骨草-桂枝-威灵仙-伸筋草-红花”中的有效成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、黄芩素等均属于黄酮化合物。黄酮类化合物与糖结合形成苷，可发挥良好的消炎、镇痛作用[16]。现代药理学研究表明，伸筋草的主要有效成分为生物碱、三萜类、挥发油等，具有抗炎、镇痛、抗菌等药理作用，可用于治疗类风湿关节炎、颈椎病和急慢性软组织损伤等疾病[17]。《本草纲目》曰：“透骨草，治疗筋骨一切风湿疼痛挛缩，寒湿脚气”。透骨草亦可抗炎镇痛、抗菌，可用于治疗风湿性关节炎、颈椎病、肩周炎、足跟痛等疾病[18]。有研究发现，透骨草中的槲皮素、山柰酚等具有抗炎、抗过敏和抗真菌等作用，复方透骨草溶液外用时可通过抑制IL-1β发挥抗炎、抑菌作用[19-20]。红花是临床上广泛应用的活血化瘀类中药，其包含黄酮类、生物碱类、聚炔类、木脂素类、倍半萜类、多糖类等多种成分具有降血压、抗凝血、抗炎镇痛、调节免疫、抗肿瘤等作用[21]。桂枝辛甘温，可用于治疗腕腹冷痛、血寒经闭、关节痹痛等[22]。其在关节病中的应用较为广泛。黄熙杰等[22]通过桂枝加葛根汤治疗颈椎病的Meta分析发现，其可明显改善风湿性颈椎病所致的头痛、颈部疼痛、头晕等症状。吴泳昕等[23]通过83例退行性骨关节病患者的临床研究发现，补中桂枝汤治疗退行性骨关节病可获良效。威灵仙是临床上治疗风湿痹痛的要药，用于治疗风湿痹痛、肢体麻木、筋脉拘挛、屈伸不利等症。临床应用和药理学研究显示，威灵仙的抗炎效果好，以威灵仙为主药的复方治疗痹证、关节炎等疾病疗效佳[24]。综上，目前关于伸筋草、透骨草、红花、桂枝、威灵仙对CTS的应用可能与抗炎、抗风湿有关。

本研究通过无监督聚类将处方分为三类，“透骨草-桂枝-威灵仙-伸筋草-红花”为最常用处方。“透骨草-桂枝-威灵仙-伸筋草-红花”为中药外治CTS的基本药物组合，且此药物组合中的药味和功效较为集中。药味均为辛温，多具有祛风湿、温经通络、散寒止痛等功效，但其作用机制并不明确。

为此本研究继续运用网络药理方法进一步探索“透骨草-桂枝-威灵仙-伸筋草-红花”治疗CTS的作用机制。研究结果表明，“透骨草-桂枝-威灵仙-伸筋草-红花”的有效药物成分为39个，涉及谷甾醇、山柰酚、槲皮素、儿茶素、刺芒柄花素、黄芩素、木犀草素等，与CTS相关的共同作用靶点33个。PPI结果显示核心药物组合治疗CTS的关键靶点为ALB、CASP3、EGFR、MYC、ERBB2、IL6、VEGFA、FOS、CCND1、ESR1、CASP8、CASP9等，关键靶点参与卡波西肉瘤相关性疱疹病毒感染、癌症中的蛋白多糖、人类巨细胞病毒感染、PI3K-AKT信号通路、铂耐药、直肠癌、乳腺癌、丙型肝炎病毒感染、EB病毒感染、MAPK信号通路等发挥治疗CTS的作用。

PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路在调节炎症反应中发挥着重要作用[25]。PI3K/Akt通路参与细胞中的多种活动，其中PI3K家族为脂质激酶，在炎症、肿瘤、免疫学疾病及细胞内信号的转导等机制中具有重要作用；Akt，又称为蛋白激酶B，与细胞内很多信号通路有关[26-27]。PI3K信号可相互作用于树突状细胞表面的CD80/CD86，调节IL-6的分泌[28]。MAPK是细胞内广泛存在的介导细胞反应的一类丝/苏氨酸蛋白激酶信号通路，包括p38、ERK、JNK、ERK5等多个亚家族。有研究发现，p38、ERK、JNK信号转导途径的活化与骨关节炎密切相关，其可诱导软骨细胞产生基质金属蛋白酶（MMPs），加速关节软骨病理性降解等[29-30]。IL-6是单核巨噬细胞和辅助性T细胞2分泌的多效性促炎性细胞因子，类风湿关节炎患者的滑膜中大量表达IL-6，滑液中IL-6与慢性滑膜炎及关节破坏严重程度密切相关[31-32]。IL-6可通过激活MAPK信号通路导致滑膜组织炎性增生、破坏关节骨与软骨。此外，有研究[33]发现，刺芒柄花素可增加骨质疏松大鼠骨密度，下调骨组织中IL-6的表达，防治去势骨质疏松大鼠，其机制可能与抑制破骨细胞的骨吸收及调控p38 MAPK/MMP-9信号通路有关。

综上所述，本研究通过分析1 685例患者的中药处方外治CTS发现，“透骨草-桂枝-威灵仙-伸筋草-红花”为中药外治CTS的基本药物组合，其作用机制主要为通过PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路发挥抗炎效应。