鉴别猪流行性腹泻病毒ORF3基因截短株常规PCR及双重荧光PCR方法的建立及初步应用

杜 琛,廖梦娟，曾德平，唐桂浩，闭云贵，柏家果，陆 颖，速雪丽，陈 樱，韦祖樟，黄伟坚，欧阳康

(广西大学 动物科学技术学院 动物传染病与分子免疫学实验室，广西 南宁 530005)

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种以仔猪呕吐、水样腹泻为主要特征的猪肠道传染病[1]，传播途径包括被感染猪的粪便、被污染的饲料以及空气[2-4]。PED于1978年首次在英国报道，随后在世界多个国家流行[5]。2010年PED变异株在我国流行，并大规模暴发[6]。2013年美国首次暴发PED疫情，并传播至加拿大、墨西哥等北美国家[7]。目前，PED已经席卷亚洲、欧洲、美洲等大部分国家，造成了严重的经济损失。

PEDV是单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科，α冠状病毒属[8]。基因组全长约为28 kb，包含2个复制酶蛋白：ORF1a和ORF1b蛋白；4个结构蛋白：纤突(spike，S)蛋白、小膜(envelope，E)蛋白、膜(membrane，M)蛋白、核衣壳(nucleocapsid，N)蛋白；1个非结构蛋白：辅助(ORF3)蛋白[9]。PEDV ORF3基因全长675 bp，位于S和E基因之间，编码1个含有224 aa的蛋白[10]。ORF3蛋白氨基酸序列与整个α冠状病毒属相比保守性较低，但具有相似的跨膜方式[11-12]。作为离子通道蛋白，ORF3蛋白可以促进细胞的自噬，抑制细胞凋亡与Ⅰ型干扰素反应[13-15]，且PEDV毒株的毒力和致病性会因其ORF3蛋白的缺失而受影响[16-17]。2015年以来，新型疫苗的开发与广泛使用，使得PED疫情在我国得到了有效的控制[18]。通过序列对比与分析可以发现，部分疫苗毒株的ORF3基因存在缺失，例如减毒CV777株(NCBI登录号：GU372744.1)、zhejiang-08株(NCBI登录号：JX002703.1)以及韩国attenuated DR13株(NCBI登录号：EU054930.1)等，因此，ORF3基因的缺失也被作为病毒适应细胞增殖的标志，来区分细胞适应毒株与野毒株[19]。本研究针对缺失的ORF3基因建立鉴别诊断方法，可有利于我们对PEDV ORF3基因的变异情况进行监测。

我国先前已发现PEDV ORF3基因自然截短株，如HLJBY株、PEDV-SX株等[20]。实验室前期从腹泻仔猪肠道样品中分离纯化得到ORF3基因自然截短和完整的2株PEDV毒株，命名为17GXCZ-1ORF3d(NCBI登录号：MT547179.1)与17GXCZ-1ORF3c(NCBI登录号：MT547180.1)[21]。两毒株主要在ORF3基因处有较大差异：与17GXCZ-1ORF3c相比，17GXCZ-1ORF3d的ORF3基因在第172～553 bp处缺失382 bp，全长只有293 bp，且由于移码导致翻译提前终止，只编码89个氨基酸。因此，本研究以实验室分离株17GXCZ-1ORF3c和17GXCZ-1ORF3d为模板，建立了常规PCR方法与双重荧光PCR方法，可特异性地鉴别PEDV ORF3基因自然截短株，为广西地区PED的临床检测及PED分子流行病学调查提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 毒株PEDV分离株17GXCZ-1ORF3d和17GXCZ-1ORF3c由本课题组分离纯化所得；猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪星状病毒(PASTV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪嵴病毒(PKV)、猪肠病毒(EVG)、猪瘟病毒(CSFV)由本实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Mix(LOT:05921KC5)购自康宁生命科学(吴江)有限公司；2×Taq Master Mix(LOT:7E220D8)和ChamQ SYBR qPCR Green Master Mix(LOT:7E571C1)购自诺唯赞生物科技股份有限公司；DNA Marker(LOT:AJG1334A)购自TaKaRa公司。LightCycler 96实时荧光定量PCR仪购自Roche公司。

1.3 临床样品221份疑似腹泻样品2017—2020年采集自广西地区不同地区的规模化猪场。

1.4 标准品的制备取200 μL于-80℃储存的17GXCZ-1ORF3d和17GXCZ-1ORF3c细胞毒样品，按照AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA Miniprep Mix的方法进行病毒总RNA提取，获得50 μL抽提样品。取16 μL病毒抽提样品反转录为cDNA，反转录体系：5×Buffer 5 μL，dNTP mix 2 μL，M-MLV Reverse Transcriptase 0.5 μL，RNasin 0.5 μL，Oligo dT 1 μL，RNA 16 μL，总体系25 μL；反转录程序：42℃ 1 h，得到浓度分别为106.41，106.67PFU/mL的标准品。以10倍梯度系列稀释标准品，于-20℃保存备用。

1.5 常规PCR检测方法的建立根据NCBI公布的17GXCZ-1ORF3d和17GXCZ-1ORF3c的ORF3基因序列，利用DNAStar软件中Megalign程序的Clustal V方法对两毒株ORF3基因序列进行对比分析，针对重合区域设计1对特异性引物ORF3-F/R，引物序列如表1所示，PCR反应体系：2×Taq Master Mix 6 μL，ORF3-F/R各0.25 μL，ddH2O 4 μL，cDNA 2 μL，总体系12.5 μL。反应条件：95℃ 2 min；95℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 10 min，4℃保存。并对该引物的退火温度进行了优化，PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 双重荧光PCR检测方法的建立根据NCBI公布的17GXCZ-1ORF3d和17GXCZ-1ORF3c的ORF3基因序列，利用DNAStar软件中Megalign程序的Clustal V方法对两毒株ORF3基因序列进行对比分析，针对非重合区域设计1对特异性引物qPCR1-F/R，并对两毒株的N基因序列设计1对特异性引物qPCR2-F/R，引物序列如表1所示。对2对引物进行普通PCR，PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。双重荧光PCR反应体系：ChamQ SYBR qPCR Green Master Mix 10 μL，qPCR1-F/R各0.5 μL，qPCR2-F/R各0.5 μL，ddH2O 6 μL，cDNA 2 μL，总体系20 μL。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 10 s，55℃ 20 s，共40个循环；95℃ 15 s，65℃ 60 s，95℃ 15 s溶解；37℃ 30 s冷却。

表1 引物信息

1.7 常规PCR和双重荧光PCR灵敏性试验将已10倍梯度稀释的标准品cDNA分别进行常规PCR与双重荧光PCR，同时设置阴性对照，检验2种方法的灵敏性。

1.8 常规PCR和双重荧光PCR特异性试验将不同的病毒，包括TGEV、PRRSV、PDCoV、PoRV、PASTV、PRV、PKV、EVG、CSFV等的cDNA作为模板，同时设置阴性和阳性对照，用建立的2种方法进行扩增，检验所建方法的特异性。

1.9 常规PCR和双重荧光PCR重复性试验从3个不同稀释浓度的标准品中各选取1份标准品，用建立的常规PCR方法进行扩增，检验该方法多次的试验结果是否能达到一致；同样从3个不同稀释浓度的标准品中各选取1份标准品，用建立的双重荧光PCR方法进行扩增根据所得的Ct值来检验该方法多次的试验结果是否能达到一致。

1.10 临床样品的检测采用双重荧光PCR方法与常规PCR方法分别对实验室收集的来自广西不同地区包括腹泻猪肠道与肛门拭子在内的221份样品进行了检测，对检测结果进行统计，并对比分析2种检测方法的阳性样品与阳性率的一致性。

2 结果

2.1 常规PCR反应条件的优化在构建常规PCR方法时，将程序中的退火温度分别设置为50，52，54，56，58，60℃确定引物最佳退火温度。结果如图1所示，当退火温度设置为56℃时，扩增的条带最佳，因此确定该引物的最佳退火温度为56℃。

M.DL2000 DNA Marker；1～6.退火温度分别为50，52，54，56，58，60℃；7～12.退火温度分别为50，52，54，56，58，60℃

2.2 引物qPCR1/2的鉴定以17GXCZ-1ORF3c为模板，对2对引物进行常规PCR，结果如图2所示，2对引物扩增条带大小分别为112，98 bp，均与预期保持一致。

M.DL2000 DNA Marker；1.引物qPCR-1(112 bp)；2.引物qPCR-2(98 bp)

2.3 双重荧光PCR扩增产物的溶解曲线分析以17GXCZ-1ORF3c为模板，同时用2对引物进行双重荧光PCR的扩增，溶解曲线有2个稳定的峰值，结果如图3所示，引物qPCR-1扩增产物的Tm值在89.5～90℃，引物qPCR-2扩增产物的Tm值在82.5～83℃，无引物二聚体及非特异性扩增产物出现。

图3 双重荧光PCR扩增产物的溶解曲线

2.4 灵敏性试验选11个稀释度的标准品进行常规PCR扩增和双重荧光PCR扩增。结果显示，常规PCR方法所能检测到的最低含量为102.41PFU/mL；而双重荧光PCR的最低检测量为100.41PFU/mL(图4)。表明本试验建立的双重荧光PCR方法具有较高的敏感性，比所建立的常规PCR方法敏感程度高100倍左右。

A.常规PCR敏感性试验(M.DL2000 DNA Marker；1～11.17GXCZ-1ORF3c标准品浓度分别为106.67～10-3.33 PFU/mL；12.阴性对照；13～23.17GXCZ-1ORF3d标准品浓度分别为106.41～10-3.59 PFU/mL)；B.双重荧光PCR敏感性试验(1～8.17GXCZ-1ORF3d标准品浓度分别为 106.41～10-0.59 PFU/mL)

2.5 特异性分析分别对TGEV、PoRV、PDCoV、PRRSV、PASTV、PRV、PKV、EVG、CSFV样品进行抽提，同时设置阴性对照和阳性对照，进行常规PCR和双重荧光PCR扩增，阳性对照为17GXCZ-1ORF3d和17GXCZ-1ORF3c。结果显示，2种PCR方法均只有阳性样品进行了扩增，其他样品均无特异性扩增，说明本方法中设计的引物具有较强的特异性(图5)。

A.常规PCR特异性试验(M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2.17GXCZ-1ORF3c；3.17GXCZ-1ORF3d；4～12.分别为TGEV、PoRV、PDCoV、PRRSV、PAstV、PRV、PKV、EVG、CSFV)；B.双重荧光PCR特异性试验(1.阴性对照；2.17GXCZ-1ORF3c；3.17GXCZ-1ORF3d；4～12.分别为TGEV、PoRV、PDCoV、PRRSV、PAstV、PRV、PKV、EVG、CSFV)

2.6 重复性分析分别选取17GXCZ-1ORF3d和17GXCZ-1ORF3c标准品进行常规PCR扩增，每个样品设置5个重复并设置阴性对照。结果如图6所示，条带均一稳定，大小与目的条带一致，证明常规PCR具有较好的重复性。选取106.41，104.41，102.41，100.41PFU/mL 4个不同浓度的17GXCZ-1ORF3d标准品分别设置3个重复性试验，结果显示，4个样品的变异系数(CV)分别为0.69%，0.80%，0.72%，0.87%，均小于1%，说明该双重荧光PCR方法具有较高的重复性(表2)。

M.DL1000 DNA Marker；1.阴性对照；2～6.17GXCZ-1ORF3c标准品；7～12.17GXCZ-1ORF3d标准品

表2 双重荧光PCR重复性试验结果

2.7 临床样品的检测采用所建立的2种方法对实验室收集到的221份临床样品进行检测，结果如表3所示，双重荧光PCR检测的阳性率为65.61%(145/221)，包含14份ORF3基因截短株单独感染样品，常规PCR检测的阳性率为57.01%(126/221)，包含107份ORF3基因完整株单独感染样品、14份ORF3基因截短株单独感染样品和5份2种类型毒株混合感染样品，所检测的总的阳性样品数与双重荧光PCR相比少19份。

表3 临床样品检测结果

3 讨论

2010年底以来，虽然通过自体疫苗、商品化疫苗、肠内容物喂养等多种方法来控制PED的暴发，但效果一直不佳。不了解PEDV变异的致病机制和免疫反应，就不能采取有效的预防措施，导致养猪场经常反复发生腹泻流行病[22]。先前研究通过对广西地区腹泻样品的监测，从腹泻仔猪肠道样品中分离纯化得到ORF3基因完整和自然截短2株PEDV毒株，因此本研究以此为基础，建立可以鉴别PEDV ORF3基因截短株的常规PCR方法与双重荧光PCR方法，实现对截短株的鉴别与监测。

本研究针对PEDV ORF3基因设计相应的引物，建立了双重荧光PCR方法与常规PCR方法。结果表明，双重荧光PCR方法熔解曲线为2个独立的峰，可以对ORF3截短基因进行鉴别；2种方法针对TGEV、PoRV、PDCoV、PRRSV、PASTV、PRV、PKV、EVG、CSFV检测均为阴性，表明特异性好；通过对双重荧光PCR方法与常规PCR方法的对比发现，双重荧光PCR检测下限达到100.41PFU/mL，比常规PCR方法灵敏100倍，敏感性很高；重复性试验CV为0.69%～0.87%，表明该方法有很好的稳定性和重复性。将建立的方法用于临床检测，结果显示：221份临床样品中，用双重荧光PCR方法检测出145份阳性样品，包含14份ORF3基因截短株单独感染样品，常规PCR检测出126份阳性样品，包含107份ORF3基因完整株单独感染样品、14份ORF3基因截短株单独感染样品和5份2种类型毒株混合感染样品。说明双重荧光PCR方法的灵敏度更高，能检测出病毒载量较低的样品。且2种方法对ORF3基因截短株单独感染样品的检测均为14份，符合率100%，可以对广西地区PEDV ORF3自然截短株的监测提供帮助。但双重荧光PCR方法在对ORF3基因完整株单独感染样品与2种类型毒株混合感染样品的检测中不能进行有效的鉴别，只能对ORF3基因截短株单独感染样品进行特异性地鉴别，仍有进一步优化的空间。

目前通过M、N等基因对PEDV进行检测的PCR方法已经较为成熟，且结果相对稳定，在实际生产中可以实现对PEDV的监测[23]。但随着PEDV减毒疫苗的广泛使用，以ORF3基因为基础对PEDV进行监测，可以更好地鉴别疫苗毒株。有研究已设计针对ORF3基因的荧光定量PCR方法用于对PEDV的检测[24]，但引物所在位置位于ORF3基因截短部分，因此不能对广西地区自然截短株进行鉴别诊断。而对临床样品的检测可以发现，近年来广西地区持续出现PEDV ORF3基因截短的临床腹泻样品，因此以ORF3基因为基础所建立的2种PCR方法更有优势，能更好地鉴别ORF3基因截短株。另外，市场上所选择的与实验室诊断相关的方法多为操作相对复杂且成本昂贵的TaqMan荧光探针法[25]，本研究构建的常规PCR与双重荧光PCR操作简单、耗时少、成本低，对大量临床样品进行检测时具有较大的优势，符合实际生产需求的同时，可以起到对猪场保护与预防的作用。

对PEDV进行有效预防的关键在于需要针对当前PEDV流行毒株进行疫苗的研制，同时依靠准确的临床诊断和对不同PEDV毒株的鉴别诊断。本研究开发的2种PCR检测方法专门针对PEDV截短的ORF3基因，除了能特异性地对PEDV ORF3基因截短株进行鉴别以外，同时为实验室临床诊断提供有利的工具。另外，通过对自然截短毒株的监测，可以更好地了解广西地区PEDV的流行态势，更好地从临床的角度判断PEDV ORF3基因自然截短的流行情况、致病情况以及毒力强弱等重要因素，从而为针对ORF3基因截短毒株开发相应的疫苗奠定基础。