抗生素发酵工艺控制和染菌分析

郑向伟 郭俊浩

（山东鲁抗医药股份有限公司，山东济宁 272500）

0.引言

通常情况下在进行抗生素生产时采用了微生物的纯种培养方式，在培养期间只允许特定的微生物进行生长和发育。如果发酵期间除抗生素以外产生了其他的菌种或出现了其他的微生物，就会发生染菌反应，会对抗生素的生长质量和整体的产量产生不良影响。在进行抗生素发酵生产时，因为操作环节比较复杂，及其容易出现染菌的情况[1]。要想对生产环节进行有效的控制就要对导致染菌问题发生的原因进行全面的查找，并且制订针对性的防控措施，才能进一步提高生产的水平。

1.抗生素发酵工艺的控制技术

1.1 做好日常的检查

（1）平板划线及显微镜检查。目前在对相关问题进行检查时存在多种技术方法，只有及时发现污染源才能避免因为这项事故的不断蔓延，导致损失问题变得更加严重。因此在对污染问题进行判断和检查的过程中，需要选择合适的技术和方法才能缩短这项工作的开展时间。比较常用的方法主要存在平板划线培养以及显微镜检查技术、肉汤培养检查技术。其中的平板划线培养技术在应用时是将已经经过灭菌处理的固体培养基，导入到灭菌的平板中，再放置培养箱中，保持37℃的试验温度。在对其保温24h之后，如果检查不存在细菌等问题，就可以正常使用。在对样品进行检查期间，首先要在无菌的平板上进行划线操作，并且将其分别设置在27℃和37℃的环境中进行培养，确保样品能够适用低温菌和嗜中菌的生长环境。一般需要对样品进行8h的观察，但这种检测方式的准确度比较低。生产人员要保证培养基的pH数值在7.0左右，还需要在其中设置1.0%的牛肉膏和0.5%的葡萄糖以及1.0%的琼脂、0.5%的氯化钠、1.0%的蛋白胨。如果采用显微镜的检查方法进行相关的操作，通常要对其进行革兰氏的染色，染色之后需要在高倍的显微镜下进行有效的观察，并且根据生产菌和杂菌的主要特征，对其进行有效的分别，并且判断是否出现污染的现象[2]。

（2）肉汤培养检查。在进行肉汤培养检查技术应用时，要将需要检查的样品倒入培养基中，并且对其进行检查，要保证肉汤培养基中不存在菌体，还要控制到27℃和37℃的温度下，分别进行培养。培养24h之后对其进行有效的观察，并且开展取样操作。这种方法经常作用于培养基和无菌空气是否存在菌体反应的检查过程中，并且将生产菌作为主要的指示菌进行相关的操作。在进行操作的过程中，主要存在葡萄糖酚红肉汤培养基，要将pH值控制在7.2左右，还要设置0.5%的葡萄糖和0.3%的牛肉膏以及0.8%的蛋白栋、0.4%的酚红溶液、0.5%的葡萄糖。在进行实际检测时，如果采用以上方法都未发现，培养基中存在污染源，也不能判定未被污染。除上述技术方法之外，还可以从发酵期间是否存在异常现象，对污染问题的发生进行准确的判断，例如溶解氧出现了剧烈的变化，pH数值的波动速度比较快，排气中的二氧化碳含量比较高或者菌体酶的活力比较旺盛。大多数情况下在发酵培养基因中使用玉米浆或者酵母粉进行相关的配置，这些物料中的菌体含量比较大，在显微镜设备下难以进行有效的观察和判断。在具体实施时要遵循相应的原则，如果培养基出现了污染现象，则菌体会呈现上升的趋势，但如果菌体的数量增加数量比较少，与培养基中所含菌的形态保持一致，则可以判断未存在污染的事件[3]。

1.2 准确判断导致这项问题发生的原因

在对污染时间和程度进行判定时，必须保证判断结果的精确性。无论是接种之前还是接种之后出现了污染，无论是补料之前还是补料之后出现的污染都要对污染源的品种和具体的发生时间进行准确的判断，还要查找是哪批料出现了问题，要明确具体的菌型，才能对其进行有效的防控。一般情况下在进行取样操作时，要在实验的环境下进行处理，避免出现误差的问题。生产人员可以适当地增加取样的数量和频率，特别是在进行批量判断时，如果内部的情况比较复杂，要增加取样的频率，为判断工作的开展提供有效的依据。要想明确这项问题的具体发生原因，生产人员还要对污染问题的发生原因进行全面的总结，要从根源上对这项问题进行扼杀。这项问题的发生，会受到多种因素的影响，但主要的原因是因为操作设备出现了泄漏或者在进行灭菌操作时存在失误以及现有的技术更新速度比较慢、无菌空气环境中存在有效的菌种[4]。一般情况下在发生污染问题之后需要利用显微镜设备，对培养基无菌斜面和肉汤进行全面的观察，并且对导致相关问题发生的原因进行有效的判断，并根据原因制定相应的解决措施，杜绝污染问题的发生。

也可以根据污染的时间对问题进行有效的判断，早期可能是因为种子存在细菌，在对设备和培养基进行灭菌操作时，没有对其进行彻底的处理或者接种出现了失误，无菌空气中出现了菌体，导致发酵后期出现了污染问题。中间补料存在污染和设备的泄漏以及生产人员的操作失误也会引发相应的问题。种子带菌是因为在进行了种子制作时，无菌样品和使用之后的剩余样品存在菌体。在对样品进行监测时，没有对所有的样品进行有效的处理，一些带菌体的种子带入操作环节会产生球菌，球菌会因为摇瓶培养基未进行灭菌处理而出现污染问题。下在对原料进行更换时，一次只够换一种类型的原料，其中就会引发大规模的污染现象。如果一直沿用传统的生产工艺，无法对其全面的消除，使用摇瓶比较大的样品进行有效的处理，在未完全验证的情况下，需要引进更加先进的工艺进行灭菌处理。但如果摇瓶装量比较大，升温速度慢，就会导致培养基内部出现污染问题。在对种子的无菌样品进行监测时，如果发现样品都处于正常的状态，需要对其他生产环节进行监测。一级种子罐中的污染问题，是因为未对其进行完全的检验就带入到发酵罐中，一般15h的时间内发酵罐就会出现污染问题。种子罐的无菌斜面可以通过镜检，对是否存在污染问题进行分析和判断。在对培养基和设备进行

灭菌操作时，如果未严格按照生产工艺的要求，对其进行有效的处理，就可能引发芽孢等现象[5]。因为无菌样品在使用的过程中极易出现污染问题，在进行设备应用时，冷却设备出现了泄漏的问题，蛇形管和连消的装置、喷淋冷却器存在穿孔现象或者夹层存在老化或者故障问题，也会引发污染现象，而污染现象的发生程度，与泄露的情况存在一定的联系。

2.染菌问题的发生原因

2.1 一级种子管接种存在缺陷

在进行火焰接种时，会导致一级种子罐内部出现污染问题。在进行接种处理时，生产人员没有严格按照相应的要求进行环境的消毒，生产人员和消毒人员也没有进行密切的配合，保证各项操作的迅速完成，就会出现接种失败的问题[6]。

2.2 蒸汽质量比较差

这项操作在实施的过程中会受到各种因素的影响，因为蒸汽质量的波动幅度比较大，内部可能会存在冷凝水问题，且总蒸汽压力比较低。一旦压力出现了骤然上升或者下降的问题都会对环境温度产生一定的影响，引发湿饱和蒸汽。在这种情况下无法对其进行有效的处理，会引发比较严重的污染问题[7]。

2.3 空气系统存在缺陷

过滤器设备在应用的过程中出现性能降低等问题，是因为污染问题的发生导致空气系统中存在有效的菌体。在进行空气过滤器设备安装时，选用的设备质量比较低或者高效滤芯的安装质量比较差，无菌环境中存在水分都会引发比较严重的污染问题。无菌环境中的油分大多是出自复式空气压缩机设备。在对污染问题进行排查时要对无油润滑空压机设备进行有效的检查[8]。

3.染菌问题的防控措施

3.1 一级种子管接种缺陷防控措施

在进行接种处理时，可以采用零磅接种或者压差接种等技术，利用零磅接种技术进行相关操作时，罐压的瞬时速度为零时，外界的空气可能会从接种处进入到内部引发污染问题，因此要提高接种区域的洁净度，可以将接种区域与其他区域进行有效的隔离。生产人员要保证罐内的卫生，还要保证实验内部始终处于密封的状态，每次进行接种处理之前要先开展消毒操作[9]。

3.2 蒸汽质量差防控措施

在生产时间允许的情况下，可以通过空消技术的应用对蒸汽中的冷凝水进行有效的排除。如果蒸汽环境处于干燥的状态，可以进行灭菌处理。在进行灭菌操作时，要开启所有的的冷凝水阀门设备，排除内部的冷凝水之后，要保证蒸汽中的含水量不断减少，再进罐处理。但这种技术属于应急方案，要想从根本上对问题进行消除，还需要对蒸汽锅炉设备的性能进行改良，要对容量和管路进行合理的设计和安装，还要做好管道的保温处理。在对管路进行安装时不能直接连接非消毒的设施，例如采暖设备等，避免管道之间的相互传播。

3.3 空气系统缺陷防控措施

在对这项问题进行预防时，首先要添加除油或者除水设备，要选择性能更加优越的设备类型，还要做好定期的排水处理，尤其是周边湿度比较大时，要提升排水的速率。可以选择无油润滑的空压机设备，从根源上对这项问题进行有效的防控。如果无法对设备性能进行有效的改造，可以在空气过滤器设备上增加玻璃棉或者活性炭，减少油雾的阻力。在对过滤器热备的滤芯进行选择时，要尽可能选择比较可靠的生产商进行产品的购买，还要选择更加先进的检测仪器和技术方法，对滤芯是否存在失效的问题进行准确的判断。在对高效过滤器设备进行安装时，要对灭菌管路进行减压或者粗略的处理，还要在进出口管路上进行监测设备的安装。要对各项构件的尺寸是否合适进行全面的检查，还要对发酵环节的生产程序进行优化处理。

4.结语

我国当前在进行抗生素发酵技术研发和试验的过程中，已经根据染菌问题的发生制定了针对性的防控技术，生产人员也对这项工作进行了高度的重视。但实际上在对发酵生产进行防控时，要从每一个环节开始进行预防。生产人员不仅要做好常规的检查工作，还需要在原有工艺技术的基础上对其进行持续的优化和完善，要提高综合的生产水平才能对生产期间存在的各项缺陷问题进行有效的控制。在我国发酵工艺不断发展的现阶段，一些新型的技术已经应用到发酵生产中，为整个行业的健康发展奠定了良好的基础。