椰毒假单胞菌酵米面亚种检测方法研究进展

梁美丹，尹玮璐，黄志深，蒋佳希，张明明，肖 剑

（广州市食品检验所，广东广州 511400）

椰毒假单胞菌酵米面亚种（Psedomonas cocovenenanssubsp.farinofermentans），最初发现于1977年的东北酵米面中毒食品中，在2003年被划分为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli）的一个病原型，该菌主要存在于谷物类发酵制品（如发酵制成的玉米面等）、薯类制品、变质的银耳和环境中[1]。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）可产生毒黄素（Toxoflavin，TF）和米酵菌酸（Bongkrekic Acid，BA）两种毒素，米酵菌酸由于不产生臭味及异味，被污染的食品肉眼上无法分辨，且高温烹饪不能去除，人体摄入微量的米酵菌酸即可引起高致病性的食品中毒，最初多发生于制作面食等东北地区。据不完全统计，20世纪中期以来，由该菌产生的米酵菌酸毒素引发的食物中毒事件已在我国涉及东北三省、云南省、浙江省、广西和广东省等16个省[2-10]，其中广东省首起米酵菌酸中毒案例报道于2018年[11]，至2020年共5起相关案例[12]。有研究报道，该菌产生的毒素引发食品中毒病死率为68%～89%[10]，其致病性强，死亡率高，是迄今为止在我国发病率和死亡率极高的食源性致病菌[13]。本文对椰毒假单胞菌酵米面亚种的检测技术方法进行了综述。

1 检测技术

1.1 微生物法培养技术

目前，我国对椰毒假单胞菌酵米面亚种的检验方法主要是《食品安全国家标准 食品微生物学检验唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验》（GB 4789.29—2020）[14]国家标准法。该方法需要根据样品类型进行不同的前处理，首先将样品进行增菌，随后在不同的平板中分离菌株，可疑菌落进行初步生化及镜检，椰毒假单胞菌酵米面亚种的许多特点与洋葱假单胞菌相似[15]，需要专业人员确认；随后将菌株纯化培养、生化鉴定，阳性结果需做毒性试验，该方法检测周期较长，无法给食品的安全性提供及时准确的判断。

1.2 基因测序技术

基因测序是基因检测的方法之一，通过读取序列信息可以对物种进行分类、分型、溯源，并从基因序列中寻找具有研究价值的片段。16S rRNA基因是研究生物系统发育及分类的框架基础，基因扩增的产物测序经比对后可确定菌株的发育关系及种属。焦振泉等[16]对不同来源样品的椰酵假单胞菌的16S rDNA测序，确定了椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌等的亲缘关系。曲春枫等[17]对代表菌株的基因片段进行16S rRNA基因扩增及测序分析，确定椰毒假单胞菌为伯克霍尔德氏菌（Burkholderia）属分类下的一个种。王岗等[18-19]对椰毒假单胞菌酵米面亚种基于16S rRNA基因进行测序分型，然后构建溯源数据库，同时建立了椰毒假单胞菌酵米面亚种荧光标记扩增片段长度多态性（FAFLP）分型方法，最后通过实验比较确定FAFLP分型的准确性高于VITEK 2 GN和16S rDNA。除此之外，黄庭轩等[20]通过recA序列分析比较了伯克霍尔德菌属中72种不同种标准株的序列以及唐菖蒲伯克霍尔德菌种内4个致病变种及环境分离株的recA序列分析，发现recA序列分析不仅能很好地鉴别伯克霍尔德菌属内不同的种，对唐菖蒲伯克霍尔德菌种内变种的区分也有参考价值。彭子欣等[21]利用基因扩增及测序技术研究唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病型菌株Co14毒力相关基因，测定基因组序列后通过同源序列比对，在菌株Co14基因组染色体1上发现米酵菌酸和毒黄素生物合成相关基因簇，根据基因簇中基因的关系预测米酵菌酸和毒黄素的生物合成过程。陈荣桥等[22]则以Co14作为参比基因对分出的34株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌野生菌株进行全基因组测序，基于多核苷酸多态性（Single Nucleotide Poiymorphism，SNP）数据构建进化树以研究案例菌株溯源关系。董银苹等[23]通过基因组测序技术及热图分析，研究唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种分离株中携带bon基因簇情况，该研究的DBJ菌株基因组成也和Co14菌株类似，米酵菌酸产毒基因簇在G2染色体内，且包含了13个基因。通过基因测序及分型所得的信息为椰毒假单胞菌酵米面亚种的研究提供理论基础。

1.3 普通PCR技术

聚合酶链式反应（Polymase Chain Reaction，PCR）是1985年发明的分子鉴定技术，并于1993年获得诺贝尔奖。赵梦馨等[24]设计研究比较3种检测方法对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的鉴定效果，结果显示，相比传统生理生化鉴定方法，MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法在鉴定中更为快速、准确。根据现有数据库信息，普通PCR及测序技术可实现椰毒假单胞菌酵米面亚种的准确鉴定，但基因扩增后，需通过凝胶电泳、产物纯化、基因测序等技术才能得到最终序列信息，时间成本消耗较大，不便于快速应用。

1.4 实时荧光PCR技术

实时荧光PCR（Quantitative Real-time PCR）技术是一种将结果快速可视化的检测手段，染料法简单方便、成本较低，而探针法灵敏度高、检测快速，相对具有更强的特异性。林捷等[25]根据椰毒假单胞菌酵米面亚种16S～18S rRNA基因片段序列设计一对特异性引物和一个TaqMan探针，该方法法抗干扰能力强，菌液的灵敏度为1×102CFU·mL-1，DNA的灵敏度为250 fg·µL-1。王晓雯等[26]基于米酵菌酸生物合成的基因bonM设计特异性引物和探针，构建唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种探针法实时荧光PCR反应体系，结果菌液检测的灵敏度为 6.5×102CFU·mL-1，DNA 检测的灵敏度为 4.8×10-4ng·μL-1。相比普通PCR检测，实时荧光PCR技术操作更简单快捷，节省时间成本，可以满足现场快速准确高通量的检测需求。

1.5 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是 2000年由 NOTOMI等[27]开发的一种新的快速核酸扩增方法。马晓燕等[28]根据公布的椰毒假单胞菌16S～23S rRNA基因序列设计引物构建LAMP检测反应体系，并将LAMP法与PCR法进行比较，结果表明LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性，椰毒假单胞菌的检出限为5.4 CFU·mL-1，是PCR方法的1 000倍，经椰毒假单胞菌人工污染的银耳样品检出限为76 CFU·g-1。环介导等温扩增技术不需要特异性探针即可实现较高特异性，设备要求较低、检测时间短，具有高特异性和等温快速扩增的特点，是快速检测应用价值极高的技术。

1.6 微滴式数字PCR技术

微 滴 式 数 字 PCR（Droplet Digital Polymerase Chain Reaction，ddPCR）是基于目标核酸分子的绝对定量技术，该技术无须依赖对照样品和标准曲线可实现精准的绝对定量检测，具有特异性强、灵敏度高、可实现准确定量等优点[29]，在微量的检测中具有较大优势。李会杰等[30]选取椰毒假单胞菌中具有高度种属特异性且高度保守的16S～23S rRNA序列作为靶序列设计引物及探针，构建微滴式数字PCR检测体系，该方法重复性好、灵敏度高，针对含不同菌液浓度的样品，该方法的检出限为361 CFU·mL-1，而用于比较的实时荧光PCR方法无法检出该浓度污染的样品。在同等条件下，微滴式数字PCR技术的高灵敏度可保证其应用于检测微量高毒力致病菌的准确性，降低了食品中微量毒性物质对消费者的威胁。

2 结语

椰毒假单胞菌酵米面亚种及其毒素自20世纪70年代在我国首次发现至今，已有国家标准实行日常监督检测，但是传统的微生物方法检验周期长、操作步骤烦琐，难以满足在食物中毒及应急事件中快速检测的需求。随着生物、化学领域技术的快速发展，分子生物学检测技术已作为一种快速检测方法被广泛应用于致病菌、病毒的检测中。因此，今后的研究重点主要针对于椰毒假单胞菌酵米面亚种快速准确的检测技术方法、不同食品中椰毒假单胞菌酵米面亚种的生长规律、风险情况、产毒机制及预防措施，有效地从原料储藏、生产加工、销售等环节预防和降低由该菌及其毒素污染引发的食物中毒。