TREM-1抑制剂对肥胖哮喘小鼠气道炎症的影响

魏水清 程慧雯 郝月琴 徐晓娜 唐华平

[摘要] 目的 探討髓样细胞触发受体1（TREM-1）抑制剂LR12对肥胖哮喘小鼠气道炎症的影响。

方法 将40只雌性C57BL/6J小鼠随机分为对照组（A组）、哮喘组（B组）、肥胖哮喘组（C组）、LR12处理肥胖哮喘组（D组）和地塞米松处理肥胖哮喘组（E组）。计算各组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中的白细胞总数和中性粒细胞比例，苏木精-伊红（HE）染色观察小鼠肺组织炎症损伤情况，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定小鼠血清白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素17A（IL-17A）的水平，实时荧光定量PCR（qPCR）法检测小鼠肺组织TREM-1、IL-17A的mRNA表达水平，蛋白印迹法测定小鼠肺组织Nod样受体蛋白3（NLRP3）、Caspase-1p20和白细胞介素1β（IL-1β）蛋白的表达。

结果 与A组比较，B组和C组小鼠出现气道损伤和炎性细胞浸润增多，BALF中白细胞总数和中性粒细胞比例、血清IL-6和IL-17A表达、肺组织TREM-1和IL-17A的mRNA表达以及NLRP3信号通路相关蛋白表达水平均明显升高，且C组上述指标变化更明显，而D组上述指标较C组均有改善，差异具有统计学意义（F=22.190～59 282.000，P<0.05）。与D组不同，E组小鼠BALF中的中性粒细胞比例较C组无明显变化（P＞0.05）。

结论 TREM-1抑制剂LR12可能通过减少NLRP3激活来减轻肥胖哮喘小鼠的气道炎症。

[关键词] 哮喘；肥胖症；髓系细胞触发受体-1；NLR家族，热蛋白结构域包含蛋白3；炎症；小鼠

[中图分类号] R562.25;R364.5

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2022）05-0739-05doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.157

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20221021.1422.008.html;2022-10-24 09：18：56

EFFECT OF TRIGGERING RECEPTOR EXPRESSED ON MYELOID CELLS-1 INHIBITOR ON AIRWAY INFLAMMATION IN OBESE ASTHMATIC MICE

WEI Shuiqing， CHENG Huiwen， HAO Yueqin， XU Xiaona， TANG Huaping

（Department of Pulmonary and Critical Care Medicine， Qingdao Municipal Hospital， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of triggering receptor expressed on myeloid cells-1 （TREM-1） inhibitor LR12 on airway inflammation in obese asthmatic mice.

Methods A total of 40 female C57BL/6J mice were randomly divided into control group （group A）， asthma group （group B）， obese asthma group （group C）， LR12-treated obese asthma group （group D）， and dexamethasone-treated obese asthma group （group E）. Total leukocyte count and neutrophil percentage in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were calculated for each group， and HE staining was used to observe the inflammatory injury of lung tissue. ELISA was used to measure the serum levels of interleukin-6 （IL-6） and interleukin-17A （IL-17A）， quantitative real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of TREM-1 and IL-17A in lung tissue， and Western blot was used to measure the protein expression levels of NOD-like receptor protein3 （NLRP3）， Caspase-1p20， and interleukin-1β （IL-1β） in lung tissue.

Results Compared with group A， group B and group C had significant increases in airway injury， inflammatory cell infiltration， total leukocyte count and neutrophil percentage in BALF， serum levels of IL-6 and IL-17A， mRNA expression levels of TREM-1 and IL-17A in lung tissue， and expression levels of proteins associated with the NLRP3 signal pathway， and group C had significantly greater changes than group B， while compared with group C， group D had significant improvements in the above indices （F=22.190-59 282.000，P<0.05）. Compared with group C， group E had no significant change in neutrophil percentage in BALF （P>0.05）.

Conclusion The TREM-1 inhibitor LR12 may alleviate airway inflammation in obese asthmatic mice by reducing NLRP3 activation.

[KEY WORDS] asthma; obesity; triggering receptor expressed on myeloid cells-1; NLR family， pyrin domain-containing 3 protein; inflammation; mice

哮喘作为慢性呼吸道疾病之一，以喘息、咳嗽和呼吸困难为特征。而肥胖能增加哮喘的患病风险和严重程度。并且肥胖哮喘个体存在类固醇耐药性，对常规哮喘治疗不敏感，使这些个体的治疗变得困难。肥胖哮喘具有高度异质性，但其本质是一种慢性气道炎症，其治疗关键是控制炎症。髓样细胞触发受体-1（TREM-1）作为免疫球蛋白超家族受体，在中性粒细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞以及支气管上皮细胞等实质细胞中有所表达。它能与其他模式识别受体协同作用，促进炎症的发生发展，是固有免疫的重要组成部分。已证实抑制TREM-1能改善急性心肌梗死、急性肺损伤、动脉粥样硬化和结肠炎等多种疾病的发生和进展。然而TREM-1抑制剂LR12对肥胖哮喘的影响及机制目前尚未见报道。故本研究通过构建肥胖哮喘小鼠模型并予以相应药物处理，探讨TREM-1抑制剂LR12对肥胖哮喘小鼠气道炎症的影响及其机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 3周龄清洁级雌性C57BL/6J小鼠40只，体质量11～13 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。本研究中使用的小鼠均按照青岛大学附属医院动物委员会批准的方案饲养。

1.1.2 主要试剂 卵清蛋白（OVA）和氢氧化铝佐剂由美国Sigma公司提供；LR12由南京肽业公司提供；地塞米松磷酸钠注射液由武汉人福药业有限公司提供；白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素17A（IL-17A）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司；Nod样受体蛋白3（NLRP3）、Caspase-1p20和白细胞介素1β（IL-1β）抗体购自万类生物科技公司。

1.2 研究方法

1.2.1 动物分组及处理 适应性喂养1周后将小鼠随机分为对照组（A组）、哮喘组（B组）、肥胖哮喘组（C组）、LR12处理肥胖哮喘组（D组）和地塞米松处理肥胖哮喘组（E组），每组8只。A、B组小鼠给予普通饲料喂养，C、D、E组小鼠给予高脂饲料（脂肪热量比60%）喂养，连续喂养15周，每周测一次体质量。8周后，高脂饲料喂养的小鼠体质量均超过普通饲料喂养小鼠体质量的20%，达到肥胖标准。按文献方法建立哮喘模型。将第9周第1天作为第1天，分别在第1、7和14天对B、C、D、E组小鼠腹腔注射含50 μg OVA和1 mg氢氧化铝佐剂的OVA致敏液；在第21～27天每天给予10 g/L的OVA雾化，每次30 min，每天1次；随后隔日雾化，持续3周。A组小鼠予以生理盐水处理。从第21天起，D、E组小鼠分别给予5 mg/kg LR12、2 mg/kg地塞米松磷酸钠注射液腹腔注射，持续4周；A、B、C组小鼠予以生理盐水处理。

1.2.2 标本采集 末次OVA激发后48 h内，腹腔注射50 g/L水合氯醛麻醉小鼠。用采血管眼球取血，静置30 min后低速离心吸取血清。采血后立即小心打开小鼠胸腔，在主支气管处结扎右肺后，分离右肺，固定于甲醛中。然后实施气管插管，应用0.7 mL预冷的PBS对左肺进行灌洗，共3次，支气管肺泡灌洗液（BALF）回收率超過80%。

1.2.3 肺组织病理学检查 右肺上叶用甲醛固定24 h，之后进行脱水、包埋、切片。切片以苏木精-伊红（HE）染色后在显微镜下观察肺炎症损伤情况。

1.2.4 BALF白细胞计数及分类 合并BALF回收液，于4 ℃下以3 000 r/min离心10 min，收集细胞沉淀并重悬浮于1 mL PBS中。于细胞计数板上计数白细胞。取其中0.2 mL细胞悬液进行涂片，迪夫快速染色后，观察细胞分布，并计算中性粒细胞比例。

1.2.5 ELISA方法测定血清IL-6和IL-17A水平

采用ELISA试剂盒进行检测，严格按试剂盒说明书操作。

1.2.6 实时荧光定量PCR（qPCR）检测TREM-1和IL-17A mRNA表达 用动物组织/细胞RNA提取试剂盒提取各组小鼠肺组织总RNA，用第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，并使用光循环仪480系统和SYBR Green Pro Taq HS Premix试剂进行qPCR。PCR所用的引物及序列见表1。以β-actin为参照，用2法计算目的基因相对表达量。

1.2.7 蛋白印迹法检测NLRP3信号通路相关蛋白表达 各组小鼠肺组织用组织匀浆机处理后，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解。上样等量的蛋白并电泳和转膜。膜于脱脂牛奶中封闭1 h，然后用稀释后的一抗 4 ℃过夜孵育。以TBST洗膜3次后加二抗孵育1 h。再清洗3次后，滴加化学发光液进行显影。使用Image J软件分析条带灰度值，结果以目的蛋白与β-actin的灰度值比值表示。

1.3 统计学分析

使用GraphPad Prism软件进行统计学处理。所得计量资料结果以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Turkey法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肥胖指标评价

喂养8周后，各组小鼠体质量比较差异有显著性（F=239.300，P<0.05），其中C、D、E组小鼠体质量增加明显高于A、B组，且体质量高20%以上，表明肥胖模型建立成功。见表2。

2.2 急性发作症状

OVA激发期间，除A组外，其余各组小鼠均出现哮喘急性发作症状，如打喷嚏、大小便次数增多、烦躁不安等，且B、C组较D、E组更严重。

2.3 BALF白细胞计数及分类

各组小鼠BALF中白细胞总数和中性粒细胞比例比较差异均有显著性（F=294.100、286.700，P<0.05）。与A组相比，B、C组小鼠BALF中白细胞总数和中性粒细胞比例显著增加（P<0.05）；与C组相比，D、E组的白细胞总数和D组的中性粒细胞比例显著降低（P<0.05），而E组的中性粒细胞比例与C组比较无明显变化（P＞0.05）。见表2。

2.4 肺组织病理学改变

与A组相比，B组小鼠气道上皮损伤、气管周围炎性细胞浸润明显，而C组变化较B组更严重，表明肥胖会加重哮喘的严重程度。而与C组相比，D组和E组小鼠气道炎症均有不同程度的减轻，说明LR12和地塞米松均具有抗炎作用。见图1。

2.5 各组小鼠血清IL-6和IL-17A水平比较

各组小鼠血清IL-6和IL-17A水平比较差异均有显著性（F=219.200、79.780，P<0.05）。与A组相比，B、C、D、E组小鼠血清IL-6和IL-17A水平均明显升高（P<0.05）；C组小鼠血清IL-6和IL-17A水平显著高于B组（P<0.05）；与C组相比，D、E组小鼠血清IL-6和IL-17A水平明显降低（P<0.05）；D组小鼠血清IL-17A水平较E组明显降低（P<0.05）。见表3。

2.6 各组小鼠TREM-1和IL-17A mRNA表达的比较

各组小鼠肺组织TREM-1和IL-17A mRNA表达水平比较差异均有显著性（F=22.190、82.650，P<0.05）。组间两两比较，B、C组小鼠肺组织中TREM-1和IL-17A mRNA表达水平较A组明显升高，其中C组升高更为明显（P<0.05）；而LR12处理能明显降低肥胖哮喘小鼠肺组织TREM-1和IL-17A mRNA表达水平（P<0.05）。见表4。

2.7 各组小鼠肺组织NLRP3信号通路相关蛋白表达比较

各组小鼠肺组织NLRP3、Caspase-1p20和IL-1β蛋白表达水平比较差异有显著性（F=603.300～59 282.000，P<0.05）。组间两两比较，B、C组小鼠肺组织NLRP3、Caspase-1p20和IL-1β蛋白表达水平较A组明显升高，其中C组升高更多（P<0.05）；而D組小鼠肺组织NLRP3、Caspase-1p20和IL-1β蛋白表达水平较C组明显下降（P<0.05）。见图2及表5。

3 讨 论

肥胖和哮喘的发病率逐年升高，已经成为全球公共卫生问题。目前肥胖哮喘的治疗仍以糖皮质激素为主，但控制不佳，且长期高剂量应用糖皮质激素将产生多种副作用。肥胖哮喘的发病机制尚未完全阐明，但目前认为与TH17细胞反应和中性粒细胞炎症密切相关，因此，这二者是改善肥胖哮喘的重要途径。

本研究应用高脂饮食联合OVA建立肥胖哮喘小鼠模型，结果表明肥胖哮喘小鼠气管周围炎性细胞浸润、血清炎性细胞因子均较哮喘小鼠增加明显，且BALF中性粒细胞增多明显，证实肥胖能加重哮喘，并且中性粒细胞炎症起着关键作用，这与有关研究结果一致。此外，本研究首次发现TREM-1在肥胖哮喘小鼠肺组织中表达上调。此前已有研究结果表明，在慢性变应性疾病动物模型中TREM-1表达上调，这为本研究的发现提供了一定的理论支持。

已证实TREM-1参与多种炎症的发生和进展，且其缺乏并不会影响病原体的清除，这是其他炎症递质作为治疗靶点所没有的优势。LR12作为TREM-1抑制剂，具有抗氧化、抗炎和免疫调节作用。且LR12在人体中很少引起不良反应，具有耐受性和稳定性。上述研究提示了LR12用于治疗炎症性疾病的可能性及优越性。本研究结果显示，LR12能抑制TREM-1表达，和地塞米松一样能减少肥胖哮喘小鼠气管周围炎性细胞浸润，减轻肺组织病理学变化，且能降低肥胖哮喘小鼠BALF的白细胞总数和血清炎症因子IL-6、IL-17A水平。这表明LR12能减轻肥胖哮喘小鼠的气道炎症反应。

IL-17A在肺组织中的表达是肥胖小鼠产生气道高反应性的必要条件。IL-17A可以诱导中性粒细胞的募集、活化和迁移。除此之外，IL-17A和IL-6也是Th17细胞分化正反馈的重要炎症因子。而中性粒细胞浸润增多和Th17细胞反应参与了肥胖哮喘的糖皮质激素抵抗。本研究结果显示，LR12能降低肥胖哮喘小鼠BALF中性粒细胞比例，而地塞米松处理则该指标无明显变化。提示LR12能明显减轻肥胖哮喘小鼠的中性粒细胞炎症和Th17细胞反应，这一点优于地塞米松。这可能是由于LR12降低IL-17A表达的作用优于地塞米松，也可能是由于中性粒细胞跨气道上皮迁徙需要TREM-1，或是TREM-1在慢性低氧下（例如肥胖哮喘）能启动Th1/Th17细胞反应。总之，上述研究提示LR12可能能够增强肥胖哮喘的糖皮质激素敏感性。

NLRP3的表达和调控在肥胖哮喘的发生发展中起着关键作用。NLRP3已被证明能驱动类固醇抵抗性中性粒细胞气道炎症，且抑制NLRP3炎性小体能减少肥胖哮喘小鼠的类固醇不敏感性气道高反应。而TREM-1能激活NLRP3，促进炎症递质的产生和扩增，提示NLRP3可能是TREM-1在肥胖哮喘中发挥作用的重要途径。本研究结果也表明，在肥胖哮喘小鼠肺组织中NLRP3信号通路相关蛋白（NLRP3、Caspase-1p20、IL-1β）的表达增加，并且LR12处理可以减轻这种改变。表明LR12能减少NLRP3炎性小体的激活，这可能是LR12减轻肥胖哮喘气道炎症的潜在机制。

综上所述，TREM-1在肥胖哮喘小鼠肺组织中表达上调，TREM-1抑制剂LR12能减轻肥胖哮喘小鼠气道炎症，这可能与LR12减少NLRP3的激活有关。然而，本研究没有对LR12减轻肥胖哮喘小鼠气道炎症的详细机制以及对糖皮质激素抵抗的影响进行探讨，仍有待进一步研究。

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（本文編辑 马伟平）