灵芝孢子粉加工工艺研究进展*

羌校君，胡 丹，黄甜甜，包振伟，张晨菊，徐春花，陈李华，陈 惠，吴伟杰

（江苏安惠药用真菌科学研究所有限公司，农业农村部食用菌加工重点实验室，江苏安惠生物科技有限公司，江苏 南通 226000）

灵芝（Ganoderma lucidum）为多孔菌科（Polyporaceae）灵芝属（Ganoderma）的药食两用真菌，是我国收录入药典的传统珍贵药材。灵芝孢子是灵芝的生殖细胞，所含的有效活性成分包括多糖类化合物、三萜类化合物、不饱和脂肪酸、糖肽、蛋白质、腺苷等[1]；其中，灵芝酸主要包括灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C等[2]。现代药理研究表明，灵芝孢子粉具有抗氧化、调节免疫、改善神经系统、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗病毒等药理作用[3]。

1 灵芝孢子破壁技术

1.1 灵芝孢子破壁的意义

在高倍显微镜下观察，灵芝孢子呈卵形至卵圆形，孢壁双层，外壁平滑，无色透明；内壁呈红褐色，有小棘突[4]。深入研究发现，灵芝孢子细胞壁质坚性稳，不易酶解，直接服用后其有效成分难以被吸收利用[5]。黄晓兰等[6]的研究结果表明，灵芝孢子粉破壁后获得的多糖含量是破壁前的1.7倍。另有研究发现，未破壁的灵芝孢子粉总三萜平均含量为2.32%，而破壁后平均含量达4.22%[7]。破壁灵芝孢子粉的吸收率和免疫活性均显著提高[8-9]。与灵芝子实体相比，灵芝孢子粉破壁后更易吸收，药用功能也显著增长[10]。

近50年来，对灵芝孢子粉的破壁工艺和技术进行了不断完善[11]，目前已知的破壁方法有5大类，即化学法、生物法、物理法、机械法和综合法。

1.2 化学法

利用食用酸或碱等化学试剂降解灵芝孢子壁，溶出并浸提得到功效成分[9]。化学法破壁能耗低，设备投入少，但存在浸提或破壁时间较长、易造成溶剂残留等问题。因此，化学法多用于破壁前处理，或与其他方法结合使用。

1.3 生物法

1.3.1 萌发破壁法

人工调控诱导灵芝孢子自行萌发破壁，所需条件包括温度、湿度、酸碱度、通氧量、光照量等[12]。研究表明，在pH 5、供氧、黑暗、28℃下培养48 h，新鲜的灵芝孢子萌发率可达70%[13]。刘昕等[14]研究发现，灵芝孢子萌发后抗癌活性显著提高。不同灵芝品种间的孢子形状与构造不尽相同，Leslie[15]指出灵芝孢子的双层厚壁结构会阻碍其萌发。需说明的是，萌发破壁法主要是借助孢子自身的能量达到破壁的目的，因此利用该法破壁的孢子必须新鲜、饱满、具有活力，而干瘪、老化的灵芝孢子不易萌发，不宜使用此法。

1.3.2 酶解破壁法

利用溶壁酶在一定条件下处理灵芝孢子粉以达到破壁的目的[16]。酶解破壁法一般情况下条件温和、可控，通常混合使用2种以上的溶壁酶。李国平[17]采用复合酶技术，添加多酶氧化酶、漆酶、纤维素酶，对细胞壁进行酶解的效果明显。杨国光[18]发现生物酶解破壁的灵芝孢子粉具有显著的增强免疫的作用。

1.3.3 溶菌法

利用溶壁菌等微生物对灵芝孢子粉进行破壁，发酵产生的蛋白酶等具有协同强化功效的作用。吴学谦等[19]利用可分泌几丁质酶的蛹虫草作为溶壁菌进行固体发酵，可达到灵芝孢子破壁的效果。

1.4 物理法

1.4.1 超声波破壁法

将一定频率和功率的超声波作用于灵芝孢子粉，使之激发剧烈振动而开裂、破壁[20]。该方法一般不单独使用，而是结合其他破壁方法一起使用以提升破壁效率。吴映明等[21]报道，超声波结合超低温冻融法破壁灵芝孢子粉，可提高其多糖提取率。

1.4.2 微波破壁法

借助微波辐射产生的高频磁场，灵芝孢子内部介质会产生大量热能，使细胞壁破裂[22]。此方法简单方便，成本低，无污染。但是微波破壁易导致灵芝孢子内部的热敏性功效物质变性或失活[23]。因此有研究人员使用微波处理结合低温深加工技术进行破壁处理，其破壁率可达99%以上[24]。

1.4.3 超低温冷冻破壁法

利用液氮等介质超低温冻结灵芝孢子，解冻产生冲击热应力使孢子壁断裂，从而实现破壁，使多糖等成分更易析出[20]。周顺华等[5]利用过冷液氮对灵芝孢子进行淬冷破壁，显示破壁率与冻结和解冻的循环次数呈正比。该方法破壁效果较好，操作简便。

1.4.4 超临界二氧化碳破壁法

以一定的温度与压力条件使二氧化碳变成液态介质，将超临界流体渗入灵芝孢子，当细胞内外压力达到平衡后突然降压，导致灵芝孢子剧烈膨胀而破裂[25]。超临界二氧化碳破壁法使用时温度低，时间短，效率高，活性成分可完全保存。Fu等[26]通过超临界二氧化碳破壁法提取灵芝孢子粉多糖，压力为35 MPa，温度为25℃，时间为4 h，二氧化碳流量为10 kg·h-1，在此破壁条件下灵芝孢子多糖提取率达2.98%，是未破壁的3倍。

1.5 机械法

1.5.1 机械超微粉碎研磨法

借助机械研磨介质产生的剪切、撞击、挤压及研磨作用，灵芝孢子间及与机械间发生碰撞和摩擦，从而实现破壁[27]。目前的超微粉碎技术分为干法和湿法，常用的有球磨式干法超微粉碎、湿法高速剪切、高压均质破壁等[28]。杜乐乐[9]采用超微粉碎法获得破壁灵芝孢子粉的免疫活性显著增强。

1.5.2 气流式超微粉碎破壁法

高压气流通过喷嘴喷出，其迅速膨胀产生超音速高湍流气流作为颗粒的载体，利用孢子之间或孢子与固定板之间产生的冲击性挤压、磨擦和剪切等作用，达到破壁[29]。肖鑫等[30]先以纤维素酶预处理灵芝孢子，再用气流式超微粉碎破壁法进行粉碎，其破壁率可达99%以上。崔宁[31]等用超临界二氧化碳流体超高压对灵芝孢子粉撞击，破壁效果良好。叶坤等[32]用真空低温微波脆化灵芝孢子壁，再进行气流粉碎30 min，破壁率达99%。

1.5.3 挤压膨化破壁法

通过对设备腔体加热，螺杆旋转对灵芝孢子进行挤压和剪切，使其因受热、高压及剪切等作用发生细胞壁破裂[33]。焦艳丽等[34]研究发现，灵芝孢子粉挤压膨化2次后，破壁率达83.48%，多糖得率为2.37%。

1.5.4 高压均质破壁法

利用柱塞泵对灵芝孢子粉加压，一定的压力下使其通过一个狭窄的间隙进行破壁，且分散的灵芝孢子粉又可在破壁后均匀混和[35]。刘春延等[36]采用高压均质法破壁灵芝孢子，以水为溶剂，均质压力为150 MPa，均质次数为3次，料液比为1∶100，此时破壁率达94.35%，且具有较好的抗肿瘤活性。

1.5.5 髙压脉冲电场破壁法

利用电穿孔原理，短时间内对灵芝孢子壁造成破坏，实现破壁[37]。刘俊丽等[38]研究结果表明，高压脉冲电场破壁灵芝孢子的最佳工艺参数为:脉冲宽度80μs，脉冲个数40 000个，电场强度25 kV·cm-1；该条件下孢子破壁率为（66.74±0.03）%，多糖溶出量为（0.99±0.11）g·100-1g-1，总三萜溶出量为（1.79±0.03）g·100-1g-1。

1.6 综合法

在灵芝孢子工业化精深加工过程中，通常根据实际情况采用多种方法结合进行破壁，既可提高生产效率，又能优化工艺效果。常用的组合破壁方法有机械与物理方法综合、机械与生物或化学方法叠加等。李淑芳等[39]综合运用萌发、超微粉碎和酶解法进行破壁，破壁率达85.38%；同时，此方法可用于灵芝孢子油提取的前处理。齐慧等[40]发现，γ射线辐照与球磨技术结合处理灵芝孢子粉的破壁率达97.18%。周萍等[41]将变温压差脆化与超微粉碎技术结合，使破壁率提高至99.5%。

多种技术的引入和结合，拓展了灵芝孢子粉破壁技术的研究应用方向，开启了极大的创新空间。Wang等[42]结合超声波和低温冷冻等技术，采用乙醇等化学试剂，协同化学反应和物理驱动，加深和扩大灵芝孢子表面浅孔，导致孢子壁变脆弱；再使用β-环糊精密封破损小孔，使孢子表面由疏水性变为亲水性，促进灵芝孢子活性成分的消化和吸收；检测三萜类化合物的溶出量、评估生物活性成分的释放效率；结果表明该方法是制备高活性、稳定性灵芝破壁孢子粉产品的有效途径。

2 灵芝孢子粉提取的技术研究

2.1 灵芝孢子活性成分的提取

2.1.1 灵芝孢子粉的热水提取技术

灵芝孢子粉的水提物以多糖为主，也含有少量的三萜与甾醇。灵芝孢子多糖从一级结构来看主要是杂多糖，但多糖的成份与破壁与否无关[43]。王会宾等[44]探究多因素对灵芝孢子多糖热水提取率的影响，其中提取温度的影响最大，其次为提取时间和液料比。黄璞[45]采用水浸法结合冷冻干燥等技术，灵芝孢子多糖提取率提高30%。研究表明，灵芝孢子多糖能显著抑制肿瘤、提升机体免疫功能，在进行预防和治疗相关疾病药物的开发方面具有较好的前景[46]。

2.1.2 灵芝孢子的醇提取技术

灵芝三萜类化合物在水中的溶解度极低，却易溶于氯仿、甲醇等有机溶剂。针对此特点，先用甲醇或乙醇提取破壁灵芝孢子粉，形成浓缩液，再用乙酸乙酯萃取分出总酸，进行分离，通过干燥层析后获得目标物。沈建英等[47]用95%乙醇回流提取破壁灵芝孢子，再经乙酸乙酯萃取，得到的提取物主要成分即为三萜类化合物。温慧萍等[48]发现，采用体积分数为80%的乙醇溶液提取的灵芝孢子粉总三萜，具有较好的抗氧化能力，对人肝癌细胞HepG-2具有一定的抑制作用。

另外，水提醇沉法是灵芝孢子多糖的常见提取方法。为提高灵芝孢子多糖提取率，通常会在水提醇沉的基础上增加超声波、微波、粉碎、酶解等工艺技术。张玲瑜等[49]得到超声波辅助提取多糖最佳工艺参数，料液比为1∶20，提取温度为35℃，提取时间为1.5 h，提取功率为450 W，此时灵芝孢子粉多糖提取率为4.99%。

2.1.3 灵芝孢子的酶提取技术

运用各种能彻底分解灵芝孢子细胞壁的酶（蛋白酶、纤维素酶等），加入破壁后的灵芝孢子粉混悬液中，提高孢子中的多糖和三萜等有效成分的溶出率。此法多在灵芝孢子破壁时采用，或结合使用。运用中性蛋白酶酶解破壁灵芝孢子粉，最佳酶解反应条件为：酶用量为2 000 IU·g-1、pH 7.5、酶解温度为60℃、酶解时间为1 h，油脂提取率为88.71%[50]。

2.2 灵芝孢子油的提取

灵芝孢子油是从灵芝孢子中萃取得到的油状脂质物，约占灵芝孢子质量的20%[51]。孢子油中有效活性物质以灵芝三萜类化合物为主[52]。直接食用灵芝孢子油能发挥免疫调节、提高机体耐缺氧能力、降低血脂、神经调节和抗肿瘤等良好的保健功效，因此在保健品和医药领域的市场应用前景广阔。早期，提取灵芝孢子油主要采用溶剂浸提法，虽然提取率高，简单易操作，但存在溶剂残留问题，不利于进一步纯化。后来在溶剂浸提法的基础上，结合超声波、微波、破碎等技术，进一步提高了灵芝孢子油提取率。目前，国内对于灵芝孢子油提取分离的方法主要有索氏提取法、超临界二氧化碳萃取法和水酶法等。

2.2.1 索氏提取法

在特定烧焙的容器中不断加入溶剂，经过多次虹吸回流后使之完全萃取。索氏提取法具有萃取效率高的特点。杨文婧等[53]试验结果显示，与超临界二氧化碳萃取法、水酶法相比，索氏抽提法的提油率最高，提取的灵芝孢子油中三萜类物质的含量约达24.45%。

2.2.2 超临界二氧化碳萃取法

超临界二氧化碳萃取（SFE-CO2）是一种高新分离技术，也是工业制备获取灵芝孢子油的常用分离方法。与传统脂溶性化合物提取技术相比，该法在常温下进行萃取，无溶剂残留，条件温和，可循环利用，成本低，纯度高，工艺流程简单，技术方法安全，且有助于易挥发性产品的保存，可以保证孢子油的品质[54]。

高宇杰等[55]在萃取压力为30 MPa、萃取温度为40℃、分离釜Ⅰ压力为8 MPa、分离釜Ⅰ温度为56℃的条件下进行萃取，灵芝孢子油的得率为29.45%。Li等[56]在此基础上进行条件优化，当压力为35 MPa、时间为3 h、温度为48℃时，得率提升至29.50%，显著高于超声提取法（23.74%），与索氏提取法（30.02%）相比无显著差异。这些研究都为灵芝孢子油的提取、鉴定及应用提供了一定的理论依据。

2.2.3 水酶法

以机械破碎为基础，利用水解酶对灵芝孢子细胞结构以及脂蛋白、脂多糖等成分进行分解，使孢子油更容易游离、流动并析出[57]。作为一种新兴的油品提取技术，水酶法工艺更为简单，对设备的要求更低，提取的油脂品质更好[58]。

3 灵芝孢子类产品的制备与选用

近年来，随着灵芝规模化栽培、深加工技术精进、产业化发展的持续进步，灵芝孢子粉的产量显著增加，产品也日渐丰富。查询相关文献及国家食品药品监督管理局官方网站，目前以灵芝孢子粉为原料的药品以单方为主；其他剂型包括复方胶囊、破壁粉胶囊、孢子粉咀嚼片、孢子精油软胶囊等，多作为保健品；功能和疗效主要涉及降血糖、降血脂、调节免疫等方面[59]。

3.1 单方灵芝孢子粉

灵芝孢子粉单方产品主要有破壁和未破壁2种，其包装形式多为袋装或者胶囊剂。目前破壁灵芝孢子粉标准体系尚不完善，仅有团体标准[60-63]，无国家标准，且各地标准的参数设置相差较大。在灵芝孢子粉的检测指标中，破壁率、活性成分以及安全性是其产品的主要检验项目。Chen等[64]发现傅里叶变换红外显微光谱（FTIR）技术是一种简单有效的鉴别灵芝孢子破壁与否的方法。姚仲青等[65]对灵芝孢子粉的破壁率、含油量、多糖含量、总三萜含量进行了较全面的研究，以期建立灵芝孢子粉的质量标准。

3.2 灵芝孢子粉合剂

将破壁灵芝孢子粉与灵芝提取物等其他不同的原料进行组合，制成冲剂、颗粒剂、咀嚼片剂等复方灵芝孢子粉制剂。王建明等[66]使用灵芝孢子粉与知母、百合、麦冬等复方制成降糖胶囊剂，可降低血糖、血脂，增强体力和免疫力，对Ⅱ型糖尿病患者有较好的治疗作用。

3.3 灵芝孢子油软胶囊

将灵芝孢子油经软胶囊注封工艺，可与番茄红素、花青素等抗氧化剂制成合剂胶囊。目前市场上灵芝孢子油多为透明的软胶囊制剂，通常以颜色和气味评价产品质量；透明度越高说明杂质含量越少，香气的纯度越髙，品质越好，而劣者相反[67]。灵芝孢子油价格较昂贵，但因与植物油外观相近，市售产品中掺加植物油或以植物油假冒灵芝孢子油的现象时有发生。因此，有研究人员采用高效液相色谱法（HPLC）建立了灵芝孢子油指纹图谱，可快速鉴别真品与混淆品[68]。

3.4 灵芝孢子油的微囊技术

微囊化技术是保护不饱和脂肪酸免于氧化降解的有效手段，可用于灵芝孢子油产品的生产和贮存，可以保证其品质。李芳等[69]以阿拉伯胶、明胶为囊材制备孢子油产品，微囊包埋率达94.32%。Zhou等[70]研究喷雾干燥法制备灵芝孢子油微囊的方法，结果表明囊材选择为阿拉伯树胶和麦芽糊精时，灵芝孢子油的氧化稳定性显著提高，多不饱和脂肪酸含量达80.04%。

4 讨论与展望

近年来，灵芝人工栽培规模、精深加工技术、产品制备工艺日趋成熟，相关研究不断深入，产业发展不断深化，较好地满足了民众对灵芝孢子粉类产品的需求。目前在国内市场上流行的灵芝类产品中，破壁灵芝孢子粉仍占据主要地位，达到灵芝类产品的40%[71]。

在实际的工业化生产中，灵芝孢子粉的破壁大多综合运用机械法和物理法，灵芝孢子油的提取则通常使用超临界二氧化碳萃取法。在对灵芝孢子进行破壁、提取、加工等产品制备的过程中，保持其有效成分的活性尤为重要，其关键点是预防和减少内含物质的氧化。

破壁灵芝孢子粉的质量评价需要制定推荐性或强制性国家标准，这是推动产业发展的重要课题。同时，一些新兴技术的发展和普及，对灵芝孢子粉的鉴定识别、活性物质含量测定、安全性评估、新品研发等带来了新的思路，展现出旺盛的创新活力。