神经鞘脂代谢与铁死亡在肝癌中的研究进展

王俊楠 金俊飞

1桂林医学院附属医院广西肝脏损伤与修复分子医学重点实验室，桂林 541001；2桂林医学院附属医院广西神经鞘脂代谢相关疾病基础研究重点实验室，桂林 541001；3桂林医学院中美健康与疾病脂质研究中心，桂林 541001；4桂林医学院附属医院肝胆胰外科实验室，桂林 541001

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，在全球癌症相关死亡中排在第4位，每年新发肝癌占癌症病例的4.7%，肝癌导致的死亡人数在肿瘤致死中占比8.3%［1］。绝大多数肝癌的病理类型为肝细胞癌，占比约90%。早期发现的肝癌通过手术治疗，能达到较好的治疗效果，但是大多数肝癌患者在中、晚期才被确诊，失去手术治疗机会，预后较差。探索肝癌生物学特征，发现更有效的治疗方案仍应为肝癌研究的重要方向。近期研究发现肝癌细胞对铁死亡激动剂敏感，而铁死亡激动剂能引起神经鞘脂代谢通路的改变。但是肝癌、铁死亡、神经鞘脂代谢三者的关系依旧不太明朗，铁死亡、神经鞘脂代谢对肝癌诊断、治疗等方面的影响也不清楚，本综述就相关方面进行讨论。

神经鞘脂代谢通路与铁死亡通路概述

1、神经鞘脂代谢通路概述

从 1986 年 Hannun 等［2］首次报道神经鞘脂分子可以作为信号分子以来，经过30 余年的研究，神经鞘脂分子及代谢酶在细胞生物过程中的作用也逐渐被认识。神经鞘脂既是细胞膜中必不可少的结构分子，也是参与多种细胞功能的第二信使，在细胞稳态、细胞凋亡等生物功能调节中起重要作用。神经鞘氨醇（sphingosine，Sph）和神经酰胺（ceramide，Cer）及其磷酸化形式神经鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1 phosphate，S1P）和 神 经 酰 胺 -1- 磷 酸（ceramide-1 phosphate，C1P）是细胞生理活动及病理过程的重要调节因子，其中S1P 和C1P 也是影响Cer 水平的重要调控因子，但其作用不尽相同。Cer 调控细胞周期、诱导细胞凋亡，而C1P 则促进细胞增殖。Cer作为神经鞘脂代谢通路的中心，主要来源于从头合成和补救合成途径，两者均发生于内质网。Cer 从头合成途径是在3-酮二氢神经鞘氨醇还原酶、丝氨酸棕榈酰转移酶和（二氢）神经酰胺合成酶（ceramide synthases，CerS）的协同作用下，将胞质中L-丝氨酸和棕榈酰辅酶A 转化为二氢神经酰胺（dihydroceramides，Dhcer），Dhcer 在二氢神经酰胺去饱和酶作用下插入双键形成 Cer；Sph 可以在 CerS 催化下生成 Cer，Cer 通过神经酰胺酶分解为Sph，Sph 和S1P 之间又可以通过神经鞘氨醇磷酸酶、神经鞘氨醇激酶相互转化，S1P 可进一步分解为乙醇胺磷酸和脂肪醛；此外，神经酰胺还可以通过神经鞘磷脂、鞘糖脂的分解以及C1P的去磷酸化产生［3］。

2、铁死亡相关信号通路概述

铁死亡（ferroptosis）由二价铁离子积累引起致命的脂质过氧化作用驱动，可以通过阻断脂质过氧化、消耗二价铁离子来抑制铁死亡，铁死亡属于程序性细胞死亡。含多不饱和脂肪酸磷脂［polyunsaturated fatty acid-containing phospholipids（PLs），PUFA-PLs）］的合成和过氧化、铁代谢失衡是铁死亡的先决条件，谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）- 还 原 性 谷 胱 甘 肽（reduced glutathione，GSH）系 统 、铁 死 亡 抑 制 蛋 白1（ferroptosis suppressor protein 1，FSP1）-泛素醌（ubiquinol，CoQH2）系统、二氢乳清酸脱氢酶（dihydroorotate dehydrogenase，DHODH）-CoQH2 系 统 、GTP 环 水 解 酶1（GTP cyclohydrolase 1，GCH1）- 四 氢 生 物 喋 呤（tetrahydrobiopterin，BH4）系统是目前已知的对抗铁死亡的主要防御系统［4］。

2.1、PUFA-PLs 的合成和过氧化 脂质过氧化的累积导致细胞膜脂质双分子层不可逆损伤，直接导致细胞铁死亡的发生。多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）在游离状态下不进行脂质过氧化。PUFAs 与膜磷脂（phospholipids，PLs）结合后形成 PUFA-PLs，PUFA-PLs的产生和过氧化是铁死亡发生的必要条件。因此，催化PUFAs 和磷脂结合的酶在铁死亡中起重要作用。乙酰辅酶A 合成酶长链家族成员4 和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3 是PUFA-PLs 合成的关键酶，两者的失活可以阻断或减弱铁死亡［5］。脂加氧酶（lipoxygenases，LOXs）可催化定向聚合氧化PUFAs，导致脂质过氧化［6］。单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFAs）缺乏双烯丙基，不容易被过氧化，MUFAs 取代PLs 中的PUFAs 能够抑制细胞膜脂质过氧化和铁死亡。硬脂酰辅酶A 去饱和酶1 和长链脂酰辅酶A合成酶3作为MUFA-PLs的合成酶，它们失活可以增加癌细胞对铁死亡的敏感性［7］。

2.2、铁代谢调节 从命名来看，铁死亡与铁有关，但是铁离子在铁死亡中的作用仍有待深入研究。生理条件下，细胞的铁吸收主要由转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1，TFR1）控制，铁结合到转铁蛋白后被受体介导的内吞作用转入细胞。这一过程可以通过敲除TFR1来阻断，进而抑制铁死亡激动剂诱导的细胞死亡［8］。铁蛋白是铁离子贮存蛋白，减少铁蛋白的表达，尤其是铁蛋白重链（ferritin heavy chain 1，FTH1）的表达，会增加不稳定的铁池，使细胞对铁死亡更敏感［9］。Gao 等［10］提出铁死亡是一种细胞自噬性死亡过程，通过自噬降解FTH1可以促进铁死亡，FTH1降解导致细胞游离铁离子增加，游离铁离子增加促进细胞铁死亡［11］。另外，在铁死亡过程中依赖铁的酶可能起到关键作用，比如最近有研究证明细胞色素P450 氧化还原酶是铁死亡期间脂质过氧化的促进因子。

2.3、GPX4-还原型谷胱甘肽（GSH）系统 GPX4 能利用GSH 催化还原H2O2或有机氢过氧化物生成水或相应的醇，其家族成员GPX4 是首个被发现的铁死亡抑制蛋白，GPX4可以作为磷脂氢过氧化物酶，将脂质过氧化氢还原为脂质醇，阻止铁依赖的脂质活性氧（lipid reactive oxygen species，L-ROS）的形成、积累，从而维持细胞内脂质稳态，阻止脂质氧化，防止铁依赖的细胞死亡模式“铁死亡”的发生［12］。GSH 是 GPX4 抑制 ROS 生成的重要辅因子，Erastin通过抑制胱氨酸谷氨酸反向转运体，减少胱氨酸进入细胞，降低细胞内GSH 水平，GPX4 活性下降，导致铁死亡发生。此外，共价小分子物质RSL3可以通过抑制GPX4酶活性，诱导铁死亡的发生。总之，随着铁死亡研究的深入，GPX4 在铁死亡发生过程中的作用及机制逐渐被认识，GPX4已经成为铁死亡检测的标志物。

2.4、FSP1 FSP1 定位于质膜，是一种 NADP 依赖的氧化还原酶，能将辅酶Q（coenzyme Q，CoQ）还原为CoQH2，后者可以通过捕获脂质过氧自由基从而抑制脂质过氧化导致的铁死亡［13］。FSP1 属于非线粒体CoQ 抗氧化系统，和GPX4 一样，是阻止铁死亡的关键蛋白。FSP1-CoQ10-NAD（P）H 途径与 GPX4-GSH 系统协同抑制磷脂过氧化和铁死亡［13］。

2.5、DHODH DHODH 位于线粒体内膜，参与嘧啶的合成，可将线粒体内膜中的CoQ 还原为CoQH2，减少线粒体脂质过氧化，抑制铁死亡。在GPX4 高表达的癌细胞中，铁死亡诱导剂引起线粒体脂质过氧化和铁死亡过程中DHODH 失活参与其中，起协同作用；在GPX4 低表达的癌细胞中，DHODH 失活诱导大量线粒体脂质过氧化和铁死亡。DHODH 底物和产物对铁死亡的影响产生相反的效果，DHODH 独立于 GPX4 和 FSP1，通过 DHODH-CoQH2系统发挥抗铁死亡作用［14］。

2.6、GCH1-BH4 系统 BH4 能捕获脂质过氧自由基，是抗氧化系统的组成部分，参与一氧化氮、神经递质和芳香族氨基酸的代谢。GCH1 是BH4 的第一限速酶，通过生成BH4 捕获自由基起抗氧化作用，并通过GCH1 介导的CoQH2抑制铁死亡。最新研究发现，在结直肠癌中GCH1/BH4 能抵抗铁死亡，抑制GCH1/BH4 能激活噬铁蛋白促进Erastin诱导的铁死亡［15］。

神经鞘脂代谢通路与铁死亡通路的交互关系及对肝癌的影响

1、神经鞘脂代谢信号通路与肝癌

神经鞘脂在调节细胞增殖、对化疗药物的反应以及癌症预防中发挥重要作用［16］。随着神经鞘脂代谢分子及代谢酶研究的深入，其在肿瘤发生、发展及治疗中的作用逐渐被了解，特别是神经鞘脂代谢紊乱对肝癌的影响。肝癌组织和癌旁正常组织相比，神经鞘脂水平发生明显变化。Krautbauer 等［17］的研究发现，Cer 作为神经鞘脂代谢中心分子，在肝癌组织中明显减少；特异性提高癌细胞Cer水平，能引起肝癌细胞死亡，可能是治疗肝癌的潜在方法。Funaki等［18］的数据表明神经鞘氨醇激酶 1（sphingosine kinase 1，SPHK1）在肝癌发生中起重要作用，在小鼠敲除SPHK1基因可以明显减少DEN 诱导的肝脏肿瘤生成。Miura 等［19］的研究表明，S1P 参与肝癌侵袭，在肿瘤进展中起重要作用，SPHK1 的表达水平与肿瘤大小有关。肝癌组织中S1P、Cer水平较癌旁正常组织明显升高。另外，S1P通过S1P受体降低肝细胞生长因子诱导的肝癌细胞迁移。碱性神经酰胺酶2（alkaline ceramidase 2，ACER2）是神经鞘脂代谢中影响细胞Cer 产生的关键酶，ACER2 可以通过酸性神经鞘磷脂酶（sphingomyelinase，SMase）样磷酸二酯酶3B 促进肝癌细胞存活和迁移［20］。类似研究认为碱性神经酰胺酶3（alkaline ceramidase 3，ACER3）可促进肝癌细胞增殖，抑制ACER2、ACER3 可能成为肝癌治疗的新思路。总之，随着研究的深入，靶向神经鞘脂代谢中间产物、代谢酶的干预措施有望在肝癌治疗中取得突破。

2、铁死亡信号通路与肝癌

越来越多的证据提示，铁死亡与肿瘤相关。索拉菲尼（sorafenib）作为多种致癌激酶的抑制剂，是肝癌靶向治疗的一线药物。研究证明索拉菲尼可诱导肝癌细胞发生铁死亡。Erastin 和索拉菲尼通过诱导铁死亡、抑制肝癌中核因子红细胞系2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）的表达和活性来发挥抗癌作用。视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein，pRb）和金属硫蛋白-1G（metallothionein-1G，MT-1G）是Nrf2 的负调控因子，与肝癌密切相关。索拉菲尼治疗肝癌导致pRb 水平下降、线粒体ROS 水平增高、铁死亡发生率增加。Sun 等［21］研究发现，敲除MT-1G 导致GSH 消耗和脂质过氧化水平显著增加，从而促进索拉非尼诱导肝癌细胞铁死亡的发生。研究表明，谷胱甘肽S-转移酶ζ1（glutathione S-transferase zeta 1，GSTZ1）通过抑制NRF2/GPX4 轴增强了索拉非尼诱导肝癌细胞铁死亡。索拉非尼与GPX4抑制剂RSL3联合治疗可能是一个有前途的肝癌治疗策略。Gao 等［22］发现：Hipo-Yes 相关蛋白/含有PDZ 结合基序的转录共激活因子（Yes-associated protein/transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，YAP/TAZ）可以诱导溶质载体家族7 成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）的表达；同时，YAP/TAZ 能维持转录激活因子4 的蛋白稳定性、核定位和转录活性，进而协同诱导SLC7A11 的表达；SLC7A11 是维持细胞内谷胱甘肽稳态的关键转运蛋白，SLC7A11表达能抑制铁死亡，导致索拉菲尼耐药。Sun 等［23］研究证实，p62-Keap1-NRF2 通路上调铁代谢、ROS 代谢的多个相关基因比如醌氧化还原酶1、血红素加氧酶1 和铁蛋白重链1 等在肝癌细胞抵抗铁死亡中发挥重要作用。

3、神经鞘脂代谢与铁死亡的关系

Cer作为神经鞘脂代谢通路的中心分子，通过影响重要效应分子发挥抑制肿瘤、对抗细胞增殖的作用，参与细胞凋亡、衰老和坏死等过程。已经证明，Cer 在多种细胞毒性药物和其他抗癌药物激发的自噬过程中发挥关键作用［24］。2016 年 Yang 等［25］的 研 究 发 现 哌 嗪 Erastin 处 理 导 致HT-1080 细胞 Cer 明显升高。Thayyullathi 等［26］研究发现不同的铁死亡诱导剂如RSL3 和FIN56 处理HT-1080 和Calu-1细胞后，Cer显著积累，提示在铁中毒过程中Cer积累不依赖于铁死亡诱导剂本身。Niu 等［27］研究发现对乙酰氨基酚诱导肝细胞铁死亡过程中Cer 含量发生变化，提示Cer可能参与其中。

在SMase 的作用下水解神经鞘磷脂（sphingomyelin，SM）生成Cer 是Cer 产生的主要来源之一，SMase 根据最适pH 分为酸性、中性、碱性3 类。中性神经鞘磷脂酶（neutral SMase，NSMase）和酸性神经鞘磷脂酶（acid SMase，ASMase）是Cer 产生的主要贡献者。NSMase 包含NSMase-1、NSMase-2、NSMase-3 和线粒体相关NSMase 4 种。我们团队研究发现：NSMase-1 在肝癌组织中低表达，SM/Cer 比值升高；NSMase-1 表达水平与肝癌预后相关，NSMase-1 高表达肝癌患者预后较好，NSMase-1 可能通过促进SM 水解生成 Cer 来 抑 制 肝 癌 的 进 展［28］。 ASMase 可 分 为 溶 酶 体ASMase 和分泌型 ASMase［29］。大量研究表明，在正常生理和许多常见疾病（包括肿瘤）的病理生理过程中ASMase 起重要作用，ASMase 可能是治疗肿瘤的重要靶点。最近研究显示，敲低ASMase 基因或药物抑制ASMase 可以减弱Erastin 诱导的自噬、GPX4 降解和脂质过氧化，从而减少Erastin 介导的铁死亡。ASMase 基因激活增加不同铁死亡诱导剂（ferroptosis inducer，FIN）处理引起的癌细胞铁死亡，ASMase在铁死亡过程中起关键作用［26］。

另外，近期有究表明脑出血诱导的SPHK1 表达促进铁死亡介导的继发性脑损伤，在这一可能致死的过程中SPHK1起关键作用［30］。该发现从侧面证实了神经鞘脂代谢与铁死亡存在密切关联。

总结与展望

PUFA-PLs的合成和氧化、铁代谢失衡是铁死亡发生的激发/促进因素和前提条件，对抗铁死亡的防御系统主要是由 GPX4、DHODH、FSP1、GCH1 等参与的抗氧化系统。激发/促进铁死亡发生的因素和对抗/防御铁死亡系统的失衡，将导致致命性过氧化物在细胞膜的堆积，进而引起铁死亡的发生。肿瘤具有独特的代谢特点，包括高负荷的活性氧和铁死亡防御系统关键蛋白的表达水平发生变化，导致肿瘤对铁死亡激动剂敏感，铁死亡相关信号分子有望成为肿瘤治疗的新靶点。已经有研究表明：铁死亡激动剂Erastin处理可以激活ASMase、引起神经酰胺生成增加、参与ROS生成和脂质过氧化，提示神经鞘脂代谢通路中的关键分子和/或代谢酶在铁死亡过程中起重要作用。虽然现有的研究表明神经鞘脂代谢通路与铁死亡存在关联，但两者的交互作用及具体机制仍不清楚，特别是两者的交互作用在肝癌研究方面还很少，加强这方面的研究，有助于从“神经鞘脂代谢通路-铁死亡”这一独特视角解释肝癌发生、发展的机制，为肝癌治疗找到新方案。