食品检测用致泻大肠埃希氏菌标准菌株的研究

大肠埃希氏菌是生活在肠道中的微生物，是肠道菌群的一部分。然而，某些大肠埃希氏菌类型可导致疾病的发生。致泻大肠埃希氏菌就是一类重要的食源性病原体，是肠道疾病相关的食源性疾病的主要原因，可在人类中传播和引起感染[1]。致泻大肠埃希氏菌（DiarrheagenicEscherichia coli，DEC）感染可导致腹痛、腹泻、出血性结肠炎等一系列疾病，是一个重要的公共卫生问题[2]。在我国，新版《食品安全国家标准 预包装食品中的致病菌限量》（GB 29921—2021）中增加了致泻大肠埃希氏菌的致病菌指标，并对肉制品和即食果蔬制品规定了限量要求。因此，其快速准确的检测已成为重点关注的食品安全问题和卫生保健相关感染问题[3]。

DEC根据其致病性机制进行分类，涉及与宿主细胞相互作用中不同的毒力基因，值得注意的是，使用传统的表型方法，如培养或基础生化测试，很难将致泻大肠埃希氏菌株与正常的粪便菌群区分开来[4]。这些年来，多重PCR、实时荧光定量PCR和等温扩增技术等新型检测技术在致泻大肠埃希氏菌分子分型检测中发挥了重要作用[5]。

标准菌株在微生物检测中发挥着至关重要的作用，是保证检验数据准确可靠的有力武器[6-7]。标准菌株必须具有清晰的基因组信息背景且稳定性良好，目前刘娜等[8]已成功研制出产肠毒素大肠埃希氏菌标准物质、肠道侵袭性大肠埃希氏菌标准物质，具有我国自主知识产权。在致泻大肠埃希氏菌的检测方法中，要求有阴阳性对照，但对标准菌株编号未作要求。本文利用生化鉴定、PCR鉴定评价了6株试验菌株作为检测标准中阴阳性对照菌株的可行性，为检测机构在选择标准菌株时提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

5株大肠埃希氏菌采购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，分别为肠道集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）CICC 24186、肠道出血性大肠埃希氏菌（EHEC）CICC 24187、肠道侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）CICC 24188、肠道致病性大肠埃希氏菌（EPEC）CICC 24189和产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）CICC 24190；1株大肠埃希氏菌ATCC 25922来源于美国标准菌株保藏中心。

1.1.2 培养基及试剂

伊红美兰琼脂（EMB）、革兰氏染色试剂盒、多重PCR检测试剂盒来源于北京陆桥技术股份有限公司；生化鉴定系统来源于法国生物梅里埃公司；6×Loading buffer、DL2000 DNA Maker均来源于宝日医生物技术有限公司；1×TAE缓冲液、琼脂糖、溴化乙锭溶液均来源于生工生物工程股份有限公司。

1.2 仪器设备

GR85DA高压蒸汽灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司；HPS-250生化培养箱，北京东联哈尔仪器制造有限公司；BSC-1360 Ⅱ B2生物安全柜，北京东联哈尔仪器制造有限公司；A200 PCR仪，杭州朗基科学仪器有限公司；JY300E电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；JY02G凝胶快速成像仪，北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌落及显微形态观察

将6株试验菌株分别接种于MAC、EMB培养基上，置于36 ℃培养24 h后，观察其菌落形态，并利用生物显微镜进行显微形态观察。

1.3.2 生化鉴定

将菌悬液接种于生化鉴定卡中，对20种生化反应进行检测鉴定；接种后置于36 ℃培养24 h，再滴加反应试剂，读取检测结果并登录鉴定系统获取鉴定结果。

1.3.3 基因组DNA提取

利用PCR试剂盒提取6株试验菌株基因组，用接种环取两环菌落，溶于200 μL裂解液中，涡旋混匀，金属浴99 ℃或沸水浴裂解20 min，冰浴冷却后12 000×g离心4 min，取上清即为模板。

1.3.4 多重PCR扩增

取PCR Buffer 23 μL加入PCR管中，再加入2 μL DNA模板，总反应体系25 μL。预变性95 ℃，5 min；变性 95 ℃，30 s，复性 63 ℃，30 s，延伸 72 ℃，1.5 min，40个循环；72 ℃延伸10 min。

1.3.5 致泻性大肠埃希氏菌毒力基因检测

参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》（GB 4789.6—2016）的方法，将获得的PCR扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳进行分析。

2 结果与分析

2.1 菌落及显微形态观察

6株试验菌株在EMB培养基上为紫黑色、光滑、湿润、边缘整齐的圆形菌落；在MAC培养基上菌落呈粉红色、圆形、表面光滑；6株试验菌株显微形态为短杆状、革兰氏阴性菌。

2.2 生化鉴定结果

将生化反应结果上传到生化鉴定系统中，鉴定结果如表1所示。6株试验菌株鉴定结果均为大肠埃希氏菌，鉴定概率百分比分别为99.9%、99.9%、99.8%、98.5%、99.8%和99.8%，置信度满足试验要求，鉴定结果可靠。

表1 6株试验菌株生化鉴定结果表

2.3 致泻性大肠埃希氏菌毒力基因检测结果

依据GB 4789.6—2016标准方法，对6株大肠埃希氏菌进行特征基因PCR扩增，如图1所示，琼脂糖凝胶电泳检测共扩增出17条目标条带，目标条带长度在150～1 500 bp。如表2所示，6株试验菌株ATCC 25922、CICC 24186、CICC 24187、CICC 24188、CICC 24189和CICC 24190检测出不同的毒力基因条带。菌株ATCC 25922只检出uidA基因条带，符合非致泻大肠埃希氏菌特征；CICC 24186检出uidA、pic、aggR、astA毒力基因，符合EAEC特征；CICC 24187检出uidA、escV、stx2、stx1毒力基因，未检出bfpB毒力基因，符合EHEC特征；CICC 24188检出uidA、invE基因，符合EIEC特征；CICC 24189检出uidA、bfpB、escV基因条带，未检出stx2、stx1条带，符合EPEC特征；CICC 24190检出uidA、estlb、estla毒力基因条带，符合ETEC特征。

图1 6株试验菌株毒力基因凝胶电泳检测结果图

表2 6株大肠埃希氏菌毒力基因特征表

3 结论与讨论

本文通过菌落及显微形态观察、生化鉴定、PCR鉴定对6株大肠埃希氏菌进行分析，并依据GB 4789.6—2016标准方法对6株大肠埃希氏菌能否作为标准菌株进行可行性分析。结果表明，6株试验菌 株 ATCC 25922、CICC 24186、CICC 24187、CICC 24188、CICC 24189和CICC 24190均检测出特征目标毒力基因条带，6株试验菌株可以作为致泻大肠埃希氏菌检验的标准菌株，满足标准要求。食品检测用致泻大肠埃希氏菌标准菌株的研究可为食品微生物工作提供依据，为检测机构在选择标准菌株时提供参考。