基于生物信息技术研究川芎-防风-麻黄角药治疗缺血性脑卒中的机制*

曹蓓苓 潘赐明 杨晓洁 范瀚中 李奇奇 夏雨欣 陈文慧

(云南中医药大学,云南 昆明 650500)

近期研究显示，河南豫东地区脑卒中发病率8.3%，上海市长宁区脑卒中报告标化发病率为166.12/10万，标化死亡率为19.62/10万，发病类型和死亡患者均以缺血性脑卒中为主，发病率高达84.74%，死亡率高达61.34%[1-2]。而另一项中国近15年调研显示，我国缺血性脑卒中发病率为145/10万，患病率为1 256/10万，死亡率为62/10万[3]。2019年与2009年相比，伤残调整寿命年增加了 5.9%，男性高于女性[4]。伤残损失健康寿命年为374.5/10万[5]。近年来，脑卒中已经成为健康的一大杀手，其死亡率第二，致残率第六，在青年卒中亦呈现上升趋势[6-7]。

角药的配伍思想来源于《黄帝内经》，首次使用则首推仲景，其中“干姜、细辛、五味子”可以说是角药之滥觞，角药之配伍具有一定的条件，如有人认为角药必须满足以下条件中的两个方可：①存在着相须相畏关系者；②存在着相反相成关系者；③存在着协同相辅关系者[8-9]。角药的主要表现形式分为独立成方之“角药”和组成方剂内容之“角药”[10]。角药包含着中医哲学理论、四气五味理论以及升降浮沉理论，能够简洁的体现出方剂“七情”配伍关系，药简而内涵丰富[11]。

基于数据挖掘 《中医方剂大辞典》中治疗中风的1130 首方剂，结果显示川芎-防风-麻黄角药是常用于治疗脑卒中的配伍组方，其支持度高达12.4%[12-13]。防风、麻黄同为辛温，但麻黄发散力强，防风为风药之润剂，两者相须相使；川芎为血中之气药，行气活血，三者配伍，既能治外风邪气，又能治血灭内风，即血行风自灭[14]。川芎-防风-麻黄亦为孙思邈的自拟续命汤的核心药物，即后世医家的大小续命汤，在临床具有较好的疗效。金·刘完素《黄帝素问·宣明论方》[15]的防风通圣散中亦含有川芎-防风-麻黄的组合，防风通圣散治疗风热雍盛、三焦热实证的患者，有效率达76.7%[16-17]。

有介于此，本文基于网络药理学对高频次的角药主要活性成分的作用靶点以及生物通路等进行综合分析，揭示川芎-防风-麻黄角药的主要活性成分及药理作用机制。

1 方法

1.1化学成分筛选 选用TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/index.htm)以口服利用度(OB)≥30%或类药性(DL)≥0.18为筛选条件，对川芎-防风-麻黄角药主要化学成分进行筛选。同时以ETCM数据库(http://www.tcmip.cn/ETCM/)为辅助查询以及检索相关文献报道，最终合并检索到的成分，通过 PubChem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)收集可能性>10%的靶点。

1.2网络构建和分析 通过检索GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD、PharmGkb数据库检索疾病相关基因，后通过UniProt数据库，得到活性成分潜在靶点的基因靶点。利用R语言VennDiagram数据包得出川芎-防风-麻黄潜在靶点和卒中相关靶点交集。将交集核心靶点上传至STRING，选择置信度≧0.95作为筛选的标准以构建PPI网络。

1.3GO及KEGG富集分析 使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8 在线富集分析平台对上述获得的相关核心靶点进行生物功能及分子信号通路的富集分析，将P value值定义小于0.05。绘制GO功能富集分析气泡图、KEGG气泡图以及通路图。

2 结果

2.1活性化合物筛选 对川芎-防风-麻黄在TCMSP数据库搜索化合物，按照OB≥30%且DL≥0.18的标准筛选出共52个活性化合，其中麻黄26个、防风19个、川芎7个，见表1。

表1 活性药物成分

2.2疾病相关基因获取 通过检索GeneCards(5545个)、OMIM(0个)、Drugbank(28个)、TTD(34个)、PharmGkb(1个)数据库检索疾病相关基因，见图1。

图1 疾病相关基因合并图

2.3川芎-防风-麻黄角药防治卒中靶点韦恩图 利用R语言VennDiagram数据包得出川芎-防风-麻黄角药潜在靶点和卒中相关靶点交集，共发现176个共同基因，确定为川芎-防风-麻黄角药治疗卒中的靶基因，生成韦恩图，见图2。

图2 核心靶点筛选韦恩图

2.4川芎-防风-麻黄角药靶点与卒中相互作用网络 将候选化学成分与卒中基因靶点通过Cytoscape 3.7.1建立川芎-防风-麻黄角药成分靶点-卒中靶点群网络，中间部分菱形代表中药潜在活性成分，不同的颜色代表来自不同的药物，青色来自麻黄，紫色来自防风，红色来自川芎，外边圆性代表潜在的作用靶点，两者的相互关系如图所示，见图3。

图3 活性成分-靶点蛋白网络图

2.5蛋白相互作用分析 将交集核心靶点上传至STRING，选择置信度≧0.95作为筛选的标准以构建PPI网络，图中网络节点表示靶点蛋白，每条边表示蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系，两个节点之间，线条越多表示之间的关联度越大，见图4。使用R软件查找PPI网络核心靶点AKT1、BAD、BCL2L1、CASP、CCND1、CDKN1A、EGF、F3、FOS、IKBKB、JUN、KDR、PLAT、PLAU。

图4 核心靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络图

2.6川芎-防风-麻黄角药对治疗卒中的GO功能与KEGG富集分析 对3个核心靶点进行GO功能富集分析，选取最具有统计学意义的前30条，结果见气泡图，图5。富集结果显示：①在BP中主要涉及对营养水平的反应(response to nutrient levels)、对氧化应激的反应(response to oxidative stress)、细胞对化学应激的反应(cellular response to chemical stress)等；②在CC中靶点涉及膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain )、膜区(membrane region)等；③在MF中靶点相关分子功能主要包括DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合(RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding)、泛素样蛋白连接酶结合(ubiquitin-like protein ligase binding)。

KEGG富集结果提示川芎-防风-麻黄角药干预卒中涉及的关键基因靶点主要有PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路Kaposi肉瘤相关疱疹病毒感染(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、人巨细胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)等。见图6、图7。

图6 KEGG富集气泡图

图7 卒中通路图

3 讨论

近年来，高血压、高血脂、高血糖和高尿酸已经严重影响人民健康[18]。从危险因素来看，糖尿病、代谢综合征、颈动脉粥样硬化、高血压史与高脂血症史是影响缺血性脑卒中的最主要因素[19-20]。因此，随着慢性病发病率不断上升，脑卒中已经首当其冲。中医早在《黄帝内经》时期就有中风的相关记载，如《素问·风论》中记载“入房汗出中风”之说，以及“偏枯”的描述，奠定了“内虚邪中”的外风学说[21]。总体而言，金元以前多以内虚邪中立论，金元时期突出以内风立论，此外王履、陈士铎强调真中、类中[7]。中医治疗中风有完整的理论体系，亦有丰富的临床经验，中风无外乎正虚邪实，即气血不足，外邪侵袭，统计显示气虚、血瘀是缺血性中风主要证候要素[8]。中风发病急促，致死致残率高，急则治其标，重在驱邪活血，《金匮要略》云：“夫病痼疾加以卒病，当先治其卒病，后乃治其痼疾也”[22]。川芎-防风-麻黄角药是大、小续命汤的核心药物，经过临床检验，小续命汤在中风急性期疗效可靠[23]。全方体现了唐宋以前治疗中风病的基本思路[24]。小续命汤加减治疗能有效改善急性脑梗死病人临床总有效率OR=2.74[25]。中医大家李可老中医亦治中风不离麻黄，体现了驱邪化瘀的重要性。

网络药理学结果分析表明，川芎-防风-麻黄角药中主要活性成分豆甾醇、槲皮素、5-O-甲基维斯阿米醇苷、杨梅酮、川芎哚等。川芎具有上行头目，活血行气，祛风止痛的功效[26]。《神农本草经》[27]载：“味辛，温。主中风入脑，头痛，寒痹，筋挛，缓急，金创。”川芎的主要成分为川芎嗪、川芎哚、杨梅酮，临床研究显示川芎嗪能改善脑卒中患者的神经功能缺损评分，无明显不良反应[28]。川芎有扩张血管,改善微循环等作用[29]。川芎哚可以抑制血小板聚集、降低神经细胞炎症反应、抗中枢神经缺血损伤、抗氧化等[30]。杨梅酮具有抗氧化作用[31]。防风具有止痛解痉之功效，陶弘景《本草经集注》[32]载：“味甘、辛，温，无毒。主治大风，头眩痛，恶风，风邪，目盲无所见，风行周身，骨节疼痹，烦满。” 防风主要化学成分为升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷，具有抗凝血、抗血栓、调节机体免疫功能等药理作用[33]。麻黄具有疏风散寒之功效，叶天士《本草经解》[34]载：“气温，味苦，无毒。主中风伤寒头痛，温疟发表出汗，去邪热气，止咳逆上气，除寒热，破癥坚积聚。” 现代药理研究麻黄主要以抗氧化、抗血栓形成以通调血脉，兴奋中枢神经系统以通窍醒神[35]。麻黄非生物碱类成分对实验性高脂血症小鼠有降血脂作用，这与高脂血症史是影响缺血性脑卒中的最主要因素的研究相一致[36]，提示麻黄作用机制可能与调节血脂相关，需要进一步研究。

PPI网络表明，川芎-防风-麻黄角药中的有效成分可能通过AKT1、BAD、BCL2L1、CASP、CCND1、CDKN1A、EGF、F3、FOS、IKBKB、JUN、KDR、PLAT、PLAU等药物-疾病共有靶点进行作用。其中CASP参与细胞凋亡，而AKT1在控制细胞增殖和凋亡中发挥至关重要作用，对缺血性损伤后的神经元发挥保护作用[37-38]。

GO生物过程分析主要涉及对营养水平的反应、对氧化应激的反应、细胞对化学应激的反应等过程。KEGG结果表明川芎-防风-麻黄角药可能通过PI3K/Akt信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路Kaposi肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染等。PI3K/Akt信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用[39]。川芎-防风-麻黄角药其作用机制与激活PI3K/Akt通路相关。NF-κB信号通路的激活会增加神经系统炎症因子的表达，进一步导致增大梗死面积，从而破坏神经功能[40]，通路图显示川芎-防风-麻黄角药通过影响PKC进一步调节下游的ERK1/2、P38、JNK、AP-1、NF-κB发挥作用，抑制炎症，减小梗死面积，保护神经功能。

综上所述，本研究通过生物信息技术，对川芎-防风-麻黄角药多成分、多靶标、多通路的复杂作用机制进行研究，初步揭示川芎-防风-麻黄角药防治疾病的分子机制，本研究结果可能存在一定的局限性，需要进一步验证。