脾气亏虚与腹膜间皮细胞内质网应激诱导自噬的关系探讨

孟立锋，吴敏华，刘前程，杨端云，史 伟，樊均明

(1广西中医药大学第一附属医院肾内科，国家中医药管理局重点专科，广西 南宁 530023； 2西南医科大学中西医结合器官纤维化实验室，四川 泸州 646000； 3四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，四川 成都 610041)

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是终末期肾病患者的肾脏替代疗法之一。与血液透析相比，PD可以较好地保护残余肾功能，同时其早期生存率较高。目前使用PD的人数在欠发达国家快速增加，尤其是在中国[1]。对经济欠发达地区而言，PD已成为大部分终末期肾病患者行血液净化方式的首要选择。近年来国内外有学者提出PD优先的原则[2]，但长期过度使用PD会导致间皮下细胞基外沉积、新生血管形成等结构和功能的改变。研究表明，在PD开始后4～5 年内，约50%的患者出现腹膜超滤功能衰竭，转为血液透析[3]。腹膜超滤功能衰竭的主要因素是腹膜纤维化(peritoneal fibrosis，PF)，同时它也是患者退出PD的首要因素。PF最重要的特征就是腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cells，PMC)逐渐向间充质细胞转分化，这是PF的早期阶段和可逆过程，在PF的发生、发展中起着关键作用[4]。因此，针对性干预PMC的上皮细胞-间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)进程是防治PF的重要靶点，开发延缓或逆转EMT进程的技术或药物就成为研究者所关注的重要课题。

自噬对真核细胞维持稳态和实现更新有重要意义。自噬与PF的发生发展密切相关。研究表明，抑制自噬可减少人PMC EMT发生[5]。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是细胞内质网稳态受到体内外因素破坏时,维持细胞生存的一种自我保护机制；调控PMC ERS可以保护PMC避免受到转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)诱导的EMT[6]。ERS可诱导细胞发生自噬。针对性干预ERS诱导的自噬活性可能是防治EMT发生的重要靶点。

PF的发病机制复杂，目前缺乏有效防治措施。中医药在预防或延缓PF方面做了很多积极的研究。近年的相关研究发现，具有益气功效的中药及其制剂可能具有干预细胞ERS[7]、进而干预EMT进程、防治PF的作用。我们既往的研究发现脾气亏虚是 PD相关的腹膜早期病变的主要病机[8]，而EMT又是PF的早期事件[9]。因此，我们认为脾气亏虚与PMC ERS诱导的自噬有密切相关性，本文就二者之间的关系进行探讨，以期从健脾益气着手防治PD诱导的EMT，为中医药干预PF提供新策略。

1 PMC EMT是PF的早期阶段和可逆过程

腹膜是体内面积最大的浆膜组织，由PMC、基底膜和结缔组织组成类似“三明治”的结构。PMC对维持腹膜内环境稳态起重要作用，在非生理性的PD液、腹膜炎等因素的反复刺激下开启自我修复的程序，从而引起腹膜形态的改变[10]，促进了PF的形成。

PF的初始因素是PMC损伤。2003年YANEZ-MO首次发现PMC EMT的现象。EMT是一个复杂的动态演变过程，包括重新排列细胞结构，调节细胞分子水平及促进新生化标志物的表达。在长期PD过程中，损伤了PMC层，导致PMC逐渐失去上皮细胞形态学特征，而呈现纤维母细胞样表型，参与进行性纤维化及新生血管形成，腹膜通透性被改变，使腹膜溶质转运能力和超滤能力逐渐下降，最终导致腹膜超滤功能衰竭[11-12]。国内有学者研究表明扶肾颗粒、健脾益气方、扶肾方等中药复方可能通过干预大鼠PMC EMT进程，进而延缓PF的进展[13-15]。可见，EMT是PF的早期阶段和可逆过程，开展中医药针对PMC EMT进程防治PF的研究，体现了传统医学“既病防变”的理念。

2 PMC ERS及其诱导的自噬参与了EMT进程

内质网作为细胞内最大的膜网络结构，主要承担蛋白质的合成、折叠、修饰、组装和运输的重任。当内质网稳态受到破坏时，可能导致错误/未折叠蛋白在内质网中大量积聚，激活ERS。当发生ERS时，内质网通过启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)来保护细胞和修复细胞的损伤。适度的ERS可启动适应性UPR，恢复内质网及内环境稳态，维持细胞生存；但严重或持续的ERS使保护机制不能与损伤抗衡，导致细胞损害甚至发生凋亡。大量证据表明，ERS参与器官纤维化，在间皮细胞表型转化和凋亡中起到重要作用，ERS可以诱导肺脏和肾脏间皮细胞EMT改变，进而导致纤维化积聚[16-17]。

SHIN等[6]研究表明，PD可使PMC发生ERS，ERS参与并诱导人PMC EMT和凋亡，调控ERS可以预防TGF-β1引起的腹膜损伤。体外培养的人PMC经ERS激活剂衣霉素刺激12 h，可以出现EMT改变，当去除衣霉素干预后，EMT改变得到逆转；延长衣霉素刺激至48 h，EMT改变不能逆转；提示逆转ERS诱导的EMT呈时间依赖方式。衣霉素预处理人PMC，可以对TGF-β1诱导的EMT和凋亡起到保护作用。进一步研究发现ERS阻滞剂牛熊去氧胆酸可以改善TGF-β1诱导的EMT，说明ERS不能直接诱导EMT，但ERS是TGF-β1诱导的EMT中的主要调节因子。以上研究表明，激活ERS或阻断过度的ERS是保护PMC的重要靶点[6]。

自噬是细胞应激时启动的一种依赖于溶酶体降解的程序，通过降解错误折叠蛋白质或清除受损的细胞器来维持真核细胞的稳态。1,25(OH)2D3通过干预mTOR信号通路影响高糖诱导的人PMC自噬，进而干预EMT进程[18]。体外研究表明，脂多糖诱导自噬能触发PMC产生自主防御机制以应对大肠杆菌感染[19]。国内学者研究发现，硫化氢对高糖诱导的人PMC损伤有保护作用，其机制可能与硫化氢抑制细胞自噬有关[20]。因此，自噬是一种保护性机制。当PMC受到致病因素损伤时，增加自噬水平可以维持细胞内稳态，从而保护细胞。

多项研究表明，ERS可通过多种分子机制诱导细胞发生自噬，减轻内质网压力并促进细胞生存，且在长期应激条件下触发凋亡途径。多数研究表明，ERS诱导的自噬起到促进细胞存活的作用，但高强度或持久的应激可启动细胞依赖自噬的死亡程序[21-22]。由于两者间关系复杂，并且与PMC EMT有密切关系。因此，更好地了解ERS与自噬促生存或促凋亡信号转变的关键节点，通过治疗性干预ERS通路的靶分子来调控自噬从而减轻内质网压力，延缓EMT，有望为PF的治疗提供新的思路。

3 PMC ERS可能通过需肌醇激酶1α(inositol requiring enzyme 1α,IRE1α)/X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1, XBP1)通路诱导自噬，进而导致EMT

ERS是分泌型细胞的经典特征，由内质网表面的内质网分子伴侣蛋白[葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)]和三种跨膜信号蛋白[双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、IRE1和活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)]介导。其中，GRP78是ERS和UPR激活的标志物[23]。当错误折叠或未折叠蛋白在内质网内堆积，内质网处于应激状态时，GRP78与感受器蛋白解离，在内质网腔执行蛋白折叠功能。通过IRE1/XBP1、PERK-eIF2α和ATF6-ERSE三条信号通路完成UPR，调控细胞内蛋白质翻译、折叠和降解能力以适应内环境紊乱。

有研究表明，PERK通过eIF2α磷酸化阻止ATF4等蛋白转录，ATF4通过调控ATG转录基因如Atg5、Atg7、Atg10激活自噬，而且在过度ERS时通过降解XIAP和CHOP蛋白激活凋亡[24]。ATF6则通过 XBP1和CHOP调控自噬和凋亡[25]。可见，PERK-eIF2α和ATF6-ERSE通路不能直接调控自噬，IRE1/XBP1通路则与自噬有直接关系。IRE1/XBP1通路中IRE1是ERI型跨膜蛋白，在人体中存在α和β两种异构体，IRE1β只在小肠表达，而IRE1α在各个组织均有表达。IRE1α同时具有蛋白激酶和核酸内切酶活性，在发生ERS时，活化的IRE1α与底物XBP1的前体mRNA分子结合，移码剪接成具有活性的转录因子剪接型X- 盒结合蛋白1(spliced X-box binding protein 1，XBP1s)，激活UPR，起到保护细胞，促进细胞生存的作用。

IRE1α/XBP1通路把内质网稳态、自噬和EMT联系起来，是一个重要的桥梁。一系列研究证实其在EMT调节中的新作用。有研究表明，在ERS的早期阶段，磷酸化的IRE1α通过c-jun 氨基末端蛋白激酶解离自噬相关蛋白Beclin1/Bcl-2，近而激活自噬[26]，XBP1通过激活Beclin1触发自噬[27]。最近有研究表明ERS通路IRE1α/XBP1在肿瘤细胞EMT进程中起重要作用[28]。有研究表明，ERS通过激活GRP78、XBP1等蛋白，引起肺泡上皮细胞、近曲小管上皮细胞出现EMT改变[29]。PD患者PMC GRP78的表达与PMC EMT程度呈正相关[6]。体内和体外实验发现，XBP1s抑制剂可显著减轻高糖诱导的腹膜形态学改变及PF[30]，这些研究表明ERS通路IRE1α/XBP1可能与PMC的自噬及EMT改变有密切关系。因此我们推测，ERS通路IRE1α/XBP1可能是PD诱导PMC自噬、发生EMT改变的主要分子机制。调控IRE1α/XBP1通路影响PMC ERS及其诱导的自噬活性，激活其适应性保护机制，可能是预防PMC EMT发生的新靶点。

4 PMC ERS及其诱导的自噬可能是脾气亏虚的微观机制

PD的原理主要是利用腹膜完成血液与PD液之间的溶质交换，从而实现血液净化。但长期过度使用PD会导致腹膜损伤，出现腹膜结构和功能的改变。通过对252例接受PD≥3个月的患者进行中医证候的分析，发现PD初期以脾肾气虚证多见[31-32]。《素问·热论》中提出“脾主大腹”，说明腹膜功能与脾关系密切。大量的PD液灌入腹腔，造成人为的“水湿困脾”，长期容易损伤脾气，出现脾气亏虚的症状。曹曼等[33]研究表明，加味参苓白术散可改善患者的PD功能，降低血清中PF指标(TGF-β1、纤维连结蛋白)。我们的研究以60例持续性不卧床PD患者为研究对象，发现健脾益气法能显著改善患者疲倦乏力、纳差等临床症状，而且能降低PD透出液中TGF-β1、血管内皮生长因子的表达水平，从而保护腹膜功能[34]。脾气亏虚是腹膜早期病变的主要病机，而EMT是PF的早期阶段和可逆过程。因此，我们认为脾气亏虚与PMC EMT有密切关系，健脾益气法可能起到延缓或逆转EMT的作用。

有诸内，必形诸外。既然PD早期腹膜病变与脾气亏虚密切相关，那么PMC损伤的病理机制也应与脾气亏虚有关。中医理论认为脾主运化水液，指脾对水液的吸收、转输和布散功能。脾气健旺才能正常发挥运化水液的功能，水液在体内不停滞才能有效防止痰湿气、水饮等病理产物的产生。如果脾气亏虚，运化功能减退，则导致津液代谢障碍，多余的水液停留在局部，即可产生痰饮、湿浊等病变。

内质网具有完成蛋白质的合成和运输的功能，这与中医“脾主运化水液”的功能相似。当PMC受到致病因素损伤时， 即发生ERS(脾气亏虚、失于运化)，内质网内合成的蛋白质得不到及时的转运，错误/未折叠蛋白质在内质网中蓄积。此时，内质网通过启动UPR和诱导细胞自噬来保护PMC和修复细胞的损伤，从而维持细胞内环境稳态，有利于细胞存活。有研究表明，补脾方药能改善脾阴虚糖尿病认知功能障碍，其机制可能与调节下丘脑中自噬及ERS相关[35]。邱静[36]研究表明，加减薯蓣丸通过上调自噬水平和减轻内质网负荷，从而对APP/PS1双转基因小鼠的神经元起到保护作用。我们的研究表明，健脾益气方能有效减轻PD微炎症状态诱导的PMC损伤[15]。因此，我们推测健脾益气法可能通过调控IRE1α-XBP1通路影响PMC ERS及其诱导的自噬活性，激活PMC的适应性保护机制，延缓或逆转EMT。

5 结语

综上所述，结合目前中医药防治PF的研究成果及我们已有的工作基础，针对PMC ERS及其诱导的自噬在EMT中的发生机制与“脾气亏虚”有密切相关性，进一步研究健脾益气功效的中药，通过调控IRE1α/XBP1通路影响PMC ERS及其诱导的自噬活性，激活其适应性保护机制，逆转或延缓EMT进程，进而保护PMC结构和功能。这不仅为阐明ERS诱导PMC自噬在EMT中的发生机制提供重要的实验数据，而且对进一步开发有效保护腹膜功能和防治PF的中药方剂提供新的思路和方法。