病毒性出血热动物模型研究进展

梁 燕，郑煦暘，连建奇

( 1空军军医大学唐都医院传染科，陕西 西安 710038； 2西北大学生命科学学院，陕西 西安 710069)

病毒性出血热(viral hemorrhagic fevers，VHFs)是由多种病毒引起，以发热、出血、休克等为特征的一类重要传染病，多为自然疫源性疾病[1]。已知引起VHFs的病原体均为有包膜的RNA病毒，按照现行国际通用病毒学分类属于砂粒病毒科、汉坦病毒科、白蛉病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、丝状病毒科6个科[2]，上述病毒曾多次引起传染病疫情，其致病机制和治疗措施研究受到极大关注。2018年，WHO从疾病流行潜力及应对措施等方面对传染病进行了评估和筛选，明确了10种已知的有可能引起突发公共卫生事件、缺乏有效药物治疗和疫苗防疫、迫切需要加紧研究的疾病，其中5种为VHFs(克里米亚-刚果出血热、埃博拉病毒病、马尔堡出血热、拉沙热、裂谷热)[3]，也说明了VHFs研究的紧迫性。

人类疾病动物模型是生物医学科学研究中所建立的具有人类疾病模拟性表现的动物实验对象和材料，使用人类疾病动物模型是现代医学研究中极为重要的实验方法和手段。鉴于多种VHFs发病机制仍不完全清楚，救治措施仍然有限，开发和运用动物模型，复制VHFs发病过程，对研究VHFs具有深远意义。本文从不同疾病出发，综述VHFs动物模型研究现状及其优缺点，总结出开发理想的出血热动物模型的可能思路。

1 拉沙热(Lassa fever，LF)

LF是一种由拉沙病毒(Lassa virus，LASV)引起的、通过鼠类传播的急性动物源性传染病，病死率高，疫区主要分布在非洲西部的尼日利亚等地。据估计，西非每年有30万～50万人感染LASV，死亡5 000～10 000例[4]。2020年10月发布的《全球传染病疫情概要》指出，LF病死率高达20.6%，排名第三[5]。

1.1 啮齿动物模型

啮齿动物是LASV的天然宿主，可携带并散播病毒而自身无病理表现[6]。YUN等[7]发现敲除STAT1基因(STAT1-/-)的129Sv小鼠不仅对LASV感染高度敏感(包括临床分离株)，而且还会有脾脏坏死凋亡、肝细胞广泛损伤、播散性感染等与临床患者类似的表现，可出现致死性结局，该模型已用于LF的发病机制和免疫学研究，也可用于疫苗和抗病毒药物筛选。SHIEH等[8]建立了一种基于Pichinde病毒(与LASV一样属沙粒病毒科，是一种对人类无致病性的病毒)的杂交Hartley豚鼠模型，其与人感染LASV的组织病理学表现和病毒抗原分布相似，可作为LASV感染和发病机制研究以及疫苗和药物筛选的模型[6]。

1.2 非人灵长类动物模型

NIKLASSON等[9]采用酶联免疫吸附试验来定量检测作为人类LF模型的恒河猴血清中的LASV抗原，对建立LF的快速诊断方法做出了贡献。食蟹猴感染LASV后可出现非常类似人类LF的疾病，是疫苗和抗病毒药物评估以及发病机制研究的理想模型[9]。虽然非人灵长类动物可作为人类LF的良好模型，但其昂贵的成本使其应用受到限制。

2 肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)

HFRS是由汉坦病毒引起的一种自然疫源性疾病。主要致病的汉坦病毒有四种——汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)、汉城病毒、多布拉伐-贝尔格莱德病毒和普马拉病毒[10]。HTNV的主要宿主和传染源是黑线姬鼠。HFRS主要表现为急性肾损伤、血管通透性增加、凝血功能异常[11]。

2.1 啮齿动物模型

姚楚铮等[12]在乳鼠脑内接种汉坦病毒 A16株后，发现该病毒对新生乳鼠具有高度致病性，但与人类疾病表现不同，而成年小鼠接种后不发病。当给成年小鼠多次小剂量注射环磷酰胺以抑制其免疫功能时，小鼠由隐性感染变为急性致死性感染，病死小鼠的脑、肺和脾等器官均有明显病变，且特点与人的病理改变基本相同，为探讨其发病机制提供了思路。SHIMIZU等[13]论述重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠感染HTNV后会导致伴有肺水肿的致死性疾病，但未见HFRS所特有的出血病变。也有人发现从患者体内分离的某些毒株可引起成年小鼠肾出血。MA等[14]建立的NLRC3-/-小鼠模型感染HTNV后出现肾脏髓质出血、炎细胞浸润等病理变化和血浆中部分细胞因子表达的升高，可能有助于评估候选疫苗和治疗方法。

叙利亚仓鼠是HTNV感染的另一种常见动物模型，HTNV可在具有免疫力的仓鼠中引起致死性疾病。HOOPER等[10]研制了一种针对HTNV M片段的DNA疫苗。该疫苗对仓鼠有保护作用。PERLEY等[15]提出了一种HTNV低剂量仓鼠感染模型，增强了仓鼠模型在疫苗和治疗试验中的有效性。

2.2 其他动物模型

PERLEY等[15]证明雪貂能够被高滴度的HTNV感染，但被感染的雪貂除了体质量减轻外，没有出现肾功能损害及其他明显症状。PERLEY等[15]还首次报道暴露在HTNV下的狨猴会发生无症状感染，产生高水平的中和抗体。总体来看，目前HTNV的感染模型主要适用于试验疫苗和抗病毒药物，尚无良好的发病模型。

3 发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)

发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)是2009年我国科学家首次从一类以发热、血小板减少、白细胞减少、胃肠道症状、精神症状等为临床表现的患者体内分离出的一种新型布尼亚病毒[16]，其与白蛉病毒属的亲缘关系最近，现命名为“Dabie bandavirus”。

3.1 SFTS啮齿动物模型

中国疾病预防控制中心对C57/B16、BALB/c、叙利亚仓鼠、黄金地鼠等免疫系统健全的健康啮齿动物进行研究，结果表明上述动物对SFTSV耐受，感染SFTSV后均未出现严重感染或致死性结局[17]。该单位使用新生昆明小鼠感染SFTSV后发现，新生小鼠对SFTSV高度敏感，被感染个体均在感染后7～8 d内死亡，这可能与新生小鼠免疫功能尚未发育健全有关。同时，在免疫功能健全的健康小鼠感染SFTSV后，被感染个体均能存活，而将小鼠用丝裂霉素C处理后(抑制免疫功能)再感染SFTSV，则会出现一些感染症状甚至致死结局[17]。美国MATSUNO等[18]对缺乏α/β干扰素(interferon α/β，IFN-α/β)受体的C57/BL6小鼠进行了研究，结果表明，其感染SFTSV后的症状表现与人类SFTS病例中多脏器损伤的特点相似。日本研究人员用缺乏IFN-α/β受体的AG129小鼠来评价抗血清、利巴韦林等对SFTS的治疗作用[17]。目前，免疫缺陷小鼠特别是IFN-α/β干扰素受体敲除的小鼠已被普遍接受为SFTSV的有效动物模型。

GOWEN等[19]研究发现，感染SFTSV的仓鼠血液和大部分组织中均出现感染病毒滴度，且脾脏、肝脏出现严重炎症病变，而法匹拉韦治疗SFTSV感染的STAT2-/-仓鼠可将血清病毒载量降低3～6个数量级。

3.2 其他SFTS动物模型

MATSUNO等[18]评估SFTSV对食蟹猴的致病作用，并未观察到临床症状。我国研究人员对恒河猴也进行了类似实验，结果仅表现为轻度症状，未致病或引起死亡。

PARK等[20]提出年龄是SFTS发病率和死亡率的关键危险因素，报告了一种与年龄有关的SFTSV感染和发病机制的雪貂模型，与人类SFTS表现类似。年轻成年雪貂感染SFTSV后没有出现任何症状，而高龄雪貂感染SFTSV后表现出严重的血小板和白细胞计数减少以及高热症状，死亡率高达93%。此外，高龄雪貂的病毒载量更高。同年，PARK等[21]用SFTSV感染猫，发现猫对SFTSV高度敏感，症状与人类SFTS病例相似或更为严重。

4 登革热(Dengue fever，DF)

DF是由登革病毒(Dengue virus，DENV)引起并经伊蚊传播的一种急性传染病，分为典型、轻型和重型。重型患者可出现休克、出血症状，病情发展迅速，多因中枢性呼吸衰竭和出血性休克而在24 h内死亡。近年来，我国口岸多次检出输入性DF病例[22]。

4.1 DF啮齿动物模型

DENV感染BALB/c小鼠的动物模型可观察细胞免疫反应，用于发病机制研究、治疗药物和疫苗测试，但免疫功能健全的小鼠只能建立感染模型，无法建立致病模型。有人用DENV感染成年BALB/c小鼠及裸鼠，发现裸鼠对DENV更为敏感，证明T细胞在抗DENV感染中起重要作用[23]。还有研究者利用缺乏IFN-α/β、IFN-γ受体的AG129小鼠构建了感染模型，在感染的小鼠中发现了高水平病毒复制，感染的小鼠表现出病毒血症、血浆渗漏等体征，也产生了免疫病理反应[24]，因此，该模型成为研究DF发病机制的常用动物模型。BENTE等[25]将人脐血造血祖细胞(CD34+)移植到缺乏T、B细胞的非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic， NOD)/SCID小鼠中，构建人源化小鼠，使其感染DENV，引发人类部分对DENV的特异性免疫应答，结果小鼠出现发热、血小板减少等症状，可用于发病机制的研究和药物筛选。JANGALWE等[26]开发了干细胞因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和IL-3的人源化NSG小鼠(NSG-SGM3小鼠)，用DENV感染NSG-SGM3小鼠后，产生的特异性IgM和IgG反应水平高于对照小鼠，可能成为研究人抗DENV B细胞反应的有用模型。其他一些人源化小鼠如NRG小鼠、DRAG小鼠也被用于DENV感染模型，但均未出现人类DENV感染中的血浆渗漏和出血现象[27]。

4.2 其他DF动物模型

DENV的自然宿主是人类和伊蚊，非人灵长类动物感染后并不表现典型症状。FERNANDEZ等[28]使用恒河猴感染模型来评估一种新的DENV候选疫苗的免疫原性和限制感染后病毒复制的能力。MOI等[29]在普通狨猴模型中评估了二次异型DENV感染，即先后使用两种血清型DENV感染狨猴，结果显示，第二次感染后，狨猴会产生高水平的病毒血症，并具有某些严重DF的表现，狨猴中和抗体滴度的快速增加与人类DENV感染时的抗体应答模式类似，这表明狨猴模型可用于研究DENV感染，是DENV感染研究和疫苗开发的潜在有用动物模型。

在另一项研究中，用DENV皮下注射感染猪，可产生病毒血症、抗DF IgM、IgG和中和抗体反应，但并未出现任何症状。通过静脉注射DENV感染猪，出现皮疹和皮肤水肿的症状。对猪进行疫苗接种，可产生特异性免疫应答[30]。

5 埃博拉病毒病(Ebola virus disease，EVD)

EVD亦可称为埃博拉病，是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)引起的一种烈性传染病，其致病性强、病死率高。EVD不仅威胁着非洲的公共卫生安全，也可以通过病毒携带者危及世界。EVD呈不规律暴发特征，四季均可发病。2020年10月发布的《全球传染病疫情概要》指出，EVD病死率高达42.3%，排名第一[5]。

5.1 EVD啮齿动物模型

EBOV不能感染免疫系统完整的成年小鼠[31]，而成年的免疫缺陷小鼠如SCID小鼠可被感染致死，其临床表现不同于人类。SCID小鼠感染后仍能健康生存数周，后出现体质量下降等体征，20～25 d后死亡[32]。使用部分免疫相关基因敲除，如IFN-α/β受体或STAT基因敲除小鼠，也可以表现出类似EVD的特征。与小鼠相比较，使用豚鼠仅引起短期的非致死发热症状，但可表现出相对更为严重的凝血功能障碍，包括血小板数量减少、凝血时间延长等现象[33]。SAITO等[34]用rVSV/EBOV(假病毒)感染叙利亚仓鼠，导致其死亡，证明该动物模型可作为筛选靶向EBOV GP药物的有用工具。

5.2 EVD非人灵长类动物模型

非人灵长类动物感染EBOV后表现与人类类似，其中恒河猴、食蟹猴均对EBOV高度敏感，食蟹猴临床症状出现最快，恒河猴临床症状虽然出现时间晚[32]，但更接近于人类，该模型被广泛应用于制药行业。

6 结语

总结上述几种VHFs动物模型的研究情况，我们可以发现，目前较为成熟的动物模型多为啮齿动物和非人灵长类动物模型。在啮齿动物中，一些免疫相关基因敲除或基因缺陷的动物存在感染、发病、致死等情况，在发病机制研究中应受到关注；而非人灵长类动物表现与人类似，在药物验证和疫苗研发中应受到关注。

理想的动物模型应该具有相似性、可重复性、可靠性、适用性、可控性、易行性以及经济性等特点。动物模型应尽可能地复制人类疾病，也应尽量便于控制其疾病的发生发展，以利于研究的开展。同时，动物模型应采用容易执行的方法来特异地反映某种疾病发生、发展及其病理生理改变，从而让研究成本较低且具有较好的重复性[35]。从上述角度分析，目前VHFs动物模型仍存在以下缺陷：①感染途径单一，不能模拟气溶胶传播、虫媒传播等感染途径；②不同病毒株感染后症状不统一；③不能完全模拟人类被病毒感染发病的过程，且疾病表现与人体差异大，如现有的HTNV感染模型均不能模拟HFRS患者毛细血管损伤和血浆渗漏等严重的病理生理过程；④一些免疫相关基因敲除之后影响抗病毒免疫反应，不利于系统开展机制研究。目前，应用于VHFs的免疫缺陷动物模型较多，主要包括：T淋巴细胞功能缺陷(裸鼠)；联合免疫功能缺陷(T、B淋巴细胞功能缺陷的SCID小鼠、NOD/SCID小鼠)；其他免疫缺陷模型，如B淋巴细胞功能缺陷(XID小鼠)、NK细胞缺陷(Beige小鼠)。此外，有研究者提出，病原体感染剂量也是动物模型建立中的一个关键问题[36]。为克服现有VHFs动物模型的种种缺陷，使用基因工程技术导入来自人类的基因片段，或直接将来自人体的细胞或组织移植入小鼠所构建的人源化小鼠模型中，可能是未来VHFs动物模型研究的重要方向。例如，在应用CB17-SCID小鼠移植人免疫系统的模型构建之前，黑猩猩是适用于HIV研究的惟一动物模型，人源化小鼠模型为体内研究HIV提供了可能，而且可用于HIV感染、疾病发生过程、潜伏期以及病毒学等多方面研究。从HIV模型建立的过程可以发现人源化小鼠具有如下特征：①遗传背景清晰；②成本较低且易获得；③具备人的部分免疫功能，可模拟病原体自然感染人的过程和产生的病理变化。目前，人源化小鼠模型在DF中已有应用[27]。为了更加真实地模拟人体VHFs的病理特征，提高发病机制研究的准确性，增强治疗措施的针对性，在未来建立更多VHFs的人源化免疫系统或人源化器官动物模型很有必要。同时，不同动物模型具有各自的优势和局限性，建立包括非人灵长类动物、大动物、媒介动物等在内的多样化的动物模型体系，才能更加有效地支撑各种VHFs的发病机制、抗病毒药物和疫苗临床前评价等研究，从而为未来应对各种新发突发传染病做好充足准备。