Wilson病金属离子稳态失衡研究进展

霍如尉(综述)，朱 波(审校)

(1.南京中医药大学医学院，整合医学学院，江苏 南京 210023；2.中国药科大学生物药物学院，江苏 南京 211198)

Wilson病(Wilson′s disease，WD)又称肝豆状核变性，是由ATP7B基因突变引起的常染色体隐性铜代谢失衡疾病。WD发病年龄多在10～30岁[1]，严重影响患者的生活质量。根据最新的流行病学调查，WD的遗传患病率为13.9/10万，出生流行率为15.4/10万[2]。ATP7B是一种铜转运体，位于13q14.3位点，其生物学功能是将铜装载到反式高尔基体中新合成的铜蓝蛋白上，进而将多余的铜从反式高尔基体中转运到质膜中。ATP7B基因突变引起铜蓝蛋白和铜结合障碍，继而导致过量的铜沉积于体肝脏、脑、角膜及肾脏等处，引发这些组织器官不同程度病变[3]。尽管铜稳态失衡作为WD的典型特征已被广泛报道，目前WD的发病机制尚未完全阐明。最新研究表明，铜并非WD患者体内唯一失衡的金属元素，其他一些金属元素如铁、锌、锰、镁、钙和铝等的含量在部分患者体内也有不同程度改变[4]。本文就近年来金属离子稳态与WD关系方面的文献作一综述，以期为WD治疗及发病机制的阐明提供新的思路。

1 铜与WD

1.1WD患者铜稳态失衡 作为人体必需微量元素，铜是多种酶发挥活性的重要辅助因子。正常人体铜稳态受到精密调控，过量的铜可通过氧化应激损伤细胞，甚至引发程序性细胞死亡[5]。WD患者体内ATP7B突变导致其铜转运蛋白功能受损，进而导致铜在肝脏和大脑等部位的积聚，最终导致肝脏和大脑功能损伤[6]。WD根据其损伤部位可分为肝型WD和脑型WD，其临床表现呈现多样性。肝型WD的主要临床表现包括：持续性血清转氨酶增高，并发急性或慢性肝炎，乃至肝硬化和暴发性肝功能衰竭等。而脑型WD则表现为明显的运动障碍、语言障碍和精神症状。这些症状具有一定的非特异性，给WD的诊断和治疗带来一定的挑战性[6]。WD患者铜代谢失衡主要表征包括胆道铜排泄减少和血清游离铜水平的升高，这使得过量的铜在肝脏和大脑等组织中蓄积。

24 h尿铜含量是反映血清铜离子水平的重要指标。通常，正常人24 h尿铜含量<40 μg。当24 h尿铜含量>100 μg时，提示可能患有WD[7]。但患有暴发性肝功能衰竭、自身免疫性肝炎、淤胆型肝炎等肝脏疾病，24 h尿铜也可高达100～200 μg。因此，24 h尿铜不能作为WD确诊指标。

血清铜水平是WD治疗和监测的有效标志，高血清铜水平是WD预后不良的标志[3]。爆发型WD(Fulminant Wilson′s disease,FWD)患者的血清铜水平显著升高，预后较差。正常人血清铜蓝蛋白含量常在0.2～0.5 g/L，近95%的WD患者血清铜蓝蛋白水平常降至0.2 g/L以下，但WD患者红细胞中铜含量与正常人相比差异无统计学意义[8]。这表明，血浆铜含量上调可能主要由血浆铜蓝蛋白所结合的铜含量大幅降低所致。有研究表明，WD患者血浆中非结合铜含量升高，常高于250 μg/L，而正常人血浆非结合铜含量常低于150 μg/L[9]。血浆游离铜在急性肝功能衰竭或慢性胆汁淤积患者以及铜摄入过多者中也会上升，因此血浆游离铜离子水平在调整药物剂量中的价值优于诊断。经治疗后WD患者血浆铜离子水平<250 μg/L预示控制理想，而<50 μg/L则是长期治疗后铜耗竭的指标。

脑型WD患者病理表现主要集中在基底神经节、中脑和脑干。这些部位在核磁共振T2加权图像中的信号下降，可能是由铜积累的顺磁效应引起[10]。Litwin等[11]发现WD患者大脑额叶皮层、壳核、脑桥和齿状核中的铜含量均高于对照组，且与性别、年龄、治疗类型和疾病持续时间无关。

1.2ATP7B突变与铜稳态失衡 ATP7B在铜蓝蛋白合成的过程中发挥重要作用，其N端含有6个金属结合结构域(metal-binding domain,MBD)。MBD与铜具有高亲和力，在与抗氧化蛋白1相互作用下接受来自细胞质的铜离子，并促进铜释放到跨膜孔道中[12]。ATP7B蛋白核心区域决定了其的金属离子结合特异性，而N端金属结合区域起调节作用[12]。

膜转运蛋白ATP7B调节人体组织和细胞内铜分布及含量。当机体铜处在本底水平时，ATP7B位于反式高尔基体网络中，负责将铜转运给新合成的含铜蛋白，如铜蓝蛋白等。在肝脏中，铜蓝蛋白通过将多余的铜转运到胆道出口的小泡中，通过胆汁排泄维持系统铜稳态[3]。机体铜含量升高时，ATP7B从高尔基体转运到溶酶体，并将铜运输到溶酶体腔内。ATP7B通过与肌动蛋白p62亚基的相互作用使溶酶体发生胞吐，使溶酶体向肝细胞的小管极转移[12]。溶酶体胞吐作用促进了肝细胞中铜的清除。

H1069Q和R778L是ATP7B基因最常见的突变类型，这两种蛋白突变体仍保留有相应的铜结合能力，但其生物学构象发生改变，常引发亚细胞定位异常[13]。肝脏铜过量时，ATP7B突变体无法精准转运至高尔基复合体和溶酶体腔，从而无法通过溶酶体胞吐作用排泄过量铜，最终引发肝脏损伤[6]。ATP7B跨膜结构域1和2(TM1/TM2)在调控胞质结构域构象中发挥重要作用。通过纠正ATP7B突变体的异常亚细胞定位，有可能恢复肝细胞过量铜的排泄。研究表明，H1069Q突变体表达可激活p38和JNK信号通路，进而促进该突变体的快速降解[13]。通过抑制p38和JNK通路，可促进H1069Q突变体从内质网转移至高尔基体，恢复其铜转运功能，有效降低胞内铜含量[13]。p38和JNK通路是校正WD致突变体的潜在靶点，未来有可能为WD新型治疗策略的开发提供线索。

1.3铜稳态失衡与WD发生发展 WD患者肝内过量的铜可诱导活性氧生成，进而导致蛋白质、脂质、DNA等大分子的氧化损伤，甚至增加肝癌的发病风险。WD早期肝脏病变特征为脂肪变性，并表现出严重的线粒体能量生成和甾醇代谢障碍[14]。研究表明，WD患者肝脏铜稳态失衡的同时，p53突变频率增加。而铜离子螯合剂能够显著降低线粒体铜含量进而减轻线粒体损伤，最终减缓肝脏损伤[14]。

高铜能诱导肝细胞线粒体氧化应激，进而引发肝细胞自噬性死亡[15]。Polishchuk等[15]的研究表明，自噬有利于保护ATP7B敲除细胞免受铜过量引发的肝细胞凋亡。与野生型细胞相比，ATP7B敲除细胞中103个自噬相关基因表达显著上调。因此，自噬有可能成为WD药物研发的新方向。

2 铁与WD

2.1WD患者脑铁稳态失衡 铁是人体含量最为丰富的微量元素，正常成人体内含铁4～5 g。铁在体内主要作为血红蛋白组分参与氧运输，以及存在于细胞色素酶中参与三磷酸腺苷(5′-Adenylate triphosphate，ATP)合成等。铁作为多种酶的辅基，对机体的能量代谢和免疫功能也具有重要作用。但大脑中过量铁可诱发神经元坏死，进而导致WD等神经系统疾病。

WD患者壳核中的铁和铜含量显著增加[16]。进一步研究发现，WD患者壳核铁含量越高，则其病理严重程度越高，这可能与含铁巨噬细胞浸润增加有关。此外，Litwin等[11]发现WD组齿状核的铁含量显著高于对照组。另一项尸检研究显示，WD患者小脑纹状体、灰质、白质中铁含量也有显著增加，WD患者脑铁摄取率高于健康个体[4]。这与脑组织各区域铁沉积的表现一致。

2.2铁稳态相关基因与WD发生发展 正常人血清在体外具有较强的抗氧化能力。进一步研究表明，血清抗氧化活性与血清中去铁转铁蛋白及铜蓝蛋白含量有关[17]。WD患者体内去铁转铁蛋白和铜蓝蛋白表达水平异常或功能异常，可能导致肝脏等组织发生氧化应激损伤。

血清铜蓝蛋白是一种主要由肝脏合成的糖蛋白，主要生理功能为铜离子转运，兼具铁氧化酶活性，对机体铜稳态和铁稳态均具有重要调控作用。研究表明，WD铁稳态失衡可能与铜蓝蛋白表达大幅下调有关。铜蓝蛋白铁氧化酶活性的降低及转铁蛋白饱和度的降低也是WD患者体内铁稳态失衡的重要原因[16]。WD患者大脑多个部位铁含量均高于健康人群，这可能与转铁蛋白受体(transferrin receptor，TfR)的持续表达有关。过量的游离铜可以与铁反应蛋白1(iron response protein-1，IRP-1)结合，占据了铁与IRP-1结合位点，使IRP-1无法脱离TfR抑制基因，进而引起TfR的持续表达[18]。最终导致铁的大量积累，造成细胞氧化损伤。

WD患者血清铁蛋白水平升高，可能与转铁蛋白的低表达有关，在大多数病例的肝脏组织中铁含量维持在正常水平。研究显示，爆发型WD患者血清铁蛋白水平明显高于普通WD患者，其预后评分与血清铁蛋白水平呈正相关[4]。ROC分析显示，血清铁蛋白预测爆发型WD的最佳界值为93.5 μg/L，敏感度为92.9%，特异度为66.2%，提示血清铁蛋白水平可能是预测WD进展为FWD的重要指标[4]。

朗埃文斯肉桂大鼠(long-Evans cinnamon，LEC)大鼠是遗传性肝炎和自发性肝细胞癌的突变品系，其肝脏铜异常积累与WD患者相似。研究发现，LEC大鼠肝脏铁蛋白含量随周龄显著升高[19]。通常，肝脏铁含量的增加与血清转铁蛋白和总铁结合力的降低有关。然而，LEC大鼠血清转铁蛋白和总铁结合力都随着肝铁的增加而增加。LEC大鼠血清转铁蛋白水平异常升高，铁和铜在LEC大鼠肝脏中自发累积，可能是导致其肝脏损伤的重要原因[20]。LEC大鼠模型为研究铁稳态与WD的关系提供了线索，值得进一步深入探索。

3 锌与WD

3.1WD患者肝脏锌稳态失衡 作为人体含量仅次于铁的必需微量元素，正常人血清中锌含量为10～18 μmol/L[20]。据估计，人细胞中约10%的蛋白含有锌结合位点，需要与锌结合后发挥功能。锌广泛参与调控细胞生物学事件，包括DNA复制、基因表达、细胞生长、酶催化等。

有研究发现WD患者肝脏锌大量缺失，而大脑锌含量与分布与对照组差异无统计学意义。WD患者血浆和红细胞中锌的水平与正常对照比略有升高，但差异无统计学意义[3]。在危重WD患者中，血清锌浓度由于各组织脏器对锌的重新摄取而降低。锌水平与WD严重程度之间可能存在关联。最新研究表明，与其他类型WD相比，爆发型WD患者血清锌水平显著降低。Ranucci等[21]认为铜超载降低了锌转运体家族成员活性，进而减少肠道对锌的吸收，导致了WD患者血清锌含量的降低。

3.2锌稳态相关通路与WD发生发展 锌稳态失衡可引起细胞内活性氧积累，从而引发程序性细胞死亡。高浓度锌可通过抑制p53 mRNA转录和蛋白入核阻止过量铜引发的神经元细胞凋亡，这提示锌补充有潜力用于减缓WD神经系统症状[3]。此外，p53蛋白活性及稳定性受胞内游离锌离子调控，过量锌可改变p53蛋白构象并下调其表达水平。WD患者肝脏样本中p53高频突变可能参与了WD的肝癌转化，但WD患者p53突变与锌稳态的关系尚不明确。WD患者肝细胞内过量的铜可促进锌从p53结合位点转移，导致p53异常折叠，失去生物学功能[22]。而p53是控制金属硫蛋白(metallothionein，MT)转录的关键转录因子，WD患者p53突变或失活后，表达量下调的金属硫蛋白不足以与胞内过量的铜结合，从而导致肝脏损伤。

人体细胞锌稳态受SLC39A/ZIP家族、SLC30A/ZnT家族及MT家族精密调控。其中SLC39A/ZIP家族成员负责将锌从胞外或细胞器转运至细胞质中，SLC30A/ZnT家族成员则负责将锌从胞质转运至胞外或细胞器中。研究表明，ATP7B突变小鼠肝脏ZIP5 mRNA表达水平显著上调，这与胞内锌含量上调一致[23]。ATP7B突变小鼠ZnT1的表达呈中度升高，提示在分泌通路早期ZnT1和ZnT4与MT协同转运锌，实现酶金属化。ATP7B突变小鼠在疾病的早期阶段激活了锌的转录稳态反应[24]。铜/锌比值的增加以及MT-1/2表达居高不下，提示可能过量铜限制了蛋白质对锌的利用。然而，最近一项基于基因芯片的研究发现，WD患者肝脏活检组织ZIP5和ZIP8表达下降，提示在WD晚期存在不同的转录应答模式。

人体特定组织铜和锌的含量变化通常相反，血清高铜、低锌可能是WD重要的预后标志物[21]。铜可能通过阻止锌吸收，导致WD血清中锌水平下降。血清锌、铜水平与肝脏功能具有一定关联。相关动物研究表明，锌介导的MT表达上调不仅减轻LEC大鼠肝脏损伤，还可降低肝脏铜和铁含量[24]。LEC大鼠中，锌可能通过抑制氧化应激保护肝脏。ATP7B敲除小鼠肝脏锌含量为对照鼠2倍左右，其肝脏铜含量则是野生型小鼠的28倍左右。野生型小鼠肝脏锌水平是铜水平的4～5倍，而ATP7B敲除小鼠肝脏铜水平则是锌水平的3倍左右[24]。这提示，ATP7B敲除小鼠肝脏锌稳态失衡可能是铜稳态失衡的继发反应。

锌能够干扰铜在胃肠道的吸收，并诱导肠腔以及肝细胞中金属硫蛋白的形成，减少铜对肝脏的损伤。尽管锌剂目前主要用于维持期治疗,但同样可作为一线治疗药物,尤其是对于无症状的患者。锌剂的疗效与青霉胺相似,但耐受性明显优于青霉胺。研究表明，铜络合剂和锌剂联合使用并逐渐减少铜络合剂用量,最后改为单纯使用锌制剂维持治疗对大多数患者是经济、安全和有效的[21]。

值得一提的是，肝脏锌稳态失衡并非WD特异性指标，其他肝脏疾病也常伴有锌稳态失衡，如慢性肝病患者血清锌浓度显著降低。外源锌补充可诱导肝脏表达MT，从而减少铜吸收，保护WD肝脏免受自由基氧化损伤[24]。有研究表明，死于肝硬化的WD患者各脑区锌含量没有显著变化。锌可能通过降低血氨或其他神经毒素的含量改善慢性肝病患者的神经系统症状。口服锌制剂可能通过诱导肠内MT表达来介导保护作用。

4 铝与WD

正常人体铝含量极低，其与人体健康及疾病的关系尚不完全清楚。有研究表明，WD患者尿铝含量明显增加。肝脏活检结果表明，WD患者肝脏铝含量显著上调至1 345 μg/g(正常人肝脏铝含量<100 μg/g)[25]。WD患者血清、尿液及肝脏铝含量的升高主要由WD患者体内铝的吸收和贮存量病理性增加引起。与之相反，WD患者尸检结果显示肝脏铝处于正常生理水平[26]。这提示铝可能在WD发病不同时期作用不同。动物实验表明，过量铝具有一定的肝毒性，长时间摄入过量铝可损害肝脏显微及超微结构，进而影响肝脏功能[25]。WD患者肝脏铝含量的增加可能参与了肝脏的病变。

5 锰、镁、钙及其他金属与WD

WD患者血浆中锰含量有升高趋势，但差异无统计学意义。但WD肝硬化患者大脑皮层锰含量显著升高，同时大脑皮层铜浓度升高[27]。铜蓝蛋白可与锰相互作用，其活性降低可改变锰的神经毒性。在WD患者或获得性肝脑退行性变患者MRI的T1加权序列中，可见颅内低值信号，提示脑锰沉积。WD患者经颅超声图像上的高回声病变同样提示锰和铁的积聚。在获得性肝脑退变的患者中，大多数患者的MRI图像中可以观察到苍白球和棘突外的局部锰沉积[28]。这些结果提示，脑锰沉积可能参与了WD神经病变，通过干预脑锰沉积改善WD患者神经症状值得进一步探索。

一项基于60例接受D-青霉胺治疗的WD患儿的研究表明，WD患儿24 h尿液中铜、镁、钙、锌、汞、铅、铊、镉和锰的水平高于健康对照组[29]。其中镁、钙、锌水平的上调与D-青霉胺治疗时间呈正相关。WD患儿24 h尿液铝与砷含量显著低于健康对照组，其含量与D-青霉胺治疗时长呈负相关[29]。人体中其他一些含量较低的金属或半金属元素，如硒、锡、铬等在WD患者体内的变化尚无相关报道，有待进一步探索。

6 总结与展望

本文首先回顾了ATP7B突变所致铜稳态失衡在铜稳态中的关键作用及机制研究方面最新进展，随后系统总结了铁、锌、铝、锰、镁、钙等金属与WD的关系。尽管WD患者血清或病变部位多种金属元素含量均发生变化，但其作用不尽相同。脑组织中铁、锰及肝脏铝的蓄积可能参与了WD的发生发展。而肝脏锌的大量减少，提示补锌可一定程度减缓WD病程进展。如何利用金属组学结合转录组学、蛋白质组学及代谢组学等新兴技术全面深入挖掘WD的致病机制，并基于人体各金属稳态的相互调控关系、各金属稳态与关键通路之间的调控关系，开发潜在的新型治疗手段，值得未来进一步深入探索。