大肠菌群主要检测方法研究进展

韦巧革

（融水苗族自治县疾病预防控制中心，广西柳州，545300)

微生物学检测结果是判断食品是否符合质量要求与卫生学要求一项重要标准，食品微生物学检测指标包含三项，即大肠菌群检测、致病菌检测、细菌总数检测等[1]。目前国内外均以大肠菌群作为食品、水体污染常用指示菌，评价与判断食品被粪便污染程度和有无肠道致病菌污染可能[2]。大肠菌群是一种处于37℃、24h 能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性的革兰阴性无芽孢杆菌统称，该细菌多存在于温血动物粪便便中，人、畜粪便对外界环境污染是大肠菌群在自然界主要原因，对此，大肠菌群被国际公认为检测各种水质、食品、医药在流行病学上安全性指示菌[3]。若所检测结果为阳性，则表示药品、食品、水质中存在该菌群，并被粪便污染。研究表明[4]，大肠菌群数量和受到污染程度呈正比，数量越多，受污染越为严重。我国目前主要以多管发酵法检测大肠菌群，其是一种传统检测方式，准确性、权威性无可置疑，但因费时费力和检测费用高现无法满足人们对药品、食品等监测。对此，对于药品、食品监督急需一种快速、有效的大肠菌群检测方式[5-6]。近些年来，世界各地针对大肠菌群检测具有专门研究，文章现结合大量研究综述大肠菌群快速检测技术的进展，对其应用前景展开分析。

1 传统检测方式改进技术

1.1 试剂盒法主要依据水质、国家食品标准检测方式多管发酵方法研制而成。主要原理是将液体乳糖培养基经过固化加工后置于特制透明塑料盒中，组成试剂盒，该检测方式具有操作简单快速、结果判定清晰准确、成本低廉以及便于携带和保存等优势。赵娣伟[7]研究中针对生活饮水中大肠菌群利用试剂盒法检测，结果显示，其灵敏度在100%，特异度是98.18%，正确指数为98.18%。可见是一种科学、实用、可靠的检测方式，适于水质、食品大肠菌群的检测。

1.2 快速测试片法该检测原理是将适量乳糖、指示剂溴甲酚紫及革兰氏阳性菌抑菌剂吸附在一定面积无菌滤纸上，大肠菌群生长发酵乳糖产酸使PH 值降低，溴甲酚紫指示剂从紫色转变为黄色，在纸片上呈黄色反应，并且在菌体中含有脱氢酶还原TTC 形成红色不容性红四氮唑，从而有效显示出红色斑点，若能满足以上两种特性作为阳性结果判定标准[8]。朴相哲[9]研究中对比快速测试片法和GB 法检测在生鲜猪肉中大肠菌群结果，结果表示前者更利于在生鲜猪肉中对大肠菌群计数的统计，且有效缩短了其检测流程。

2 分子生物学技术

2.1 聚合酶链式反应法（PCR）PCR 以它的微量、重复性好、快捷等特点在医学领域中得到广泛使用。主要是利用耐热DNA聚合酶作用，通过变性、延伸、复性循环操作在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种克隆技术[10]。虽其存在较高敏感性和特异性，但因食物组分中存在多种酶抑制剂，从而影响到PCR法检出率，且PCR 法无法区分活菌和死菌，故较难对大肠菌群定量分析。

2.2 基因芯片技术基因芯片技术是近些年出现的一种新型技术，具有较强交叉性，为目前当今研究热点，是将已经设计的基因片段或寡核肝酸依据一定循序紧密排列在芯片上，荧光标记分子经PCR 扩增方式进入到微生物样品DNA，且和芯片上寡核苷酸点杂交，最后经荧光波长扫描仪利用计算机软件分析得到样品含量。祝儒刚[11]学者使用基因芯片技术对大肠埃希氏菌进行检测，灵敏度达2pg，并表示所制备的基因芯片检测实际肉及肉制品样品准确率高于传统培养法，能够作为食源性致病菌检测理想手段。贺晨[12]将该技术和PCR 技术联合应用，多种PCR 扩增，制备芯片，将扩增产物和含有探针基因芯片杂交，结果表明其对大肠杆菌特异性检测灵敏度达2x10-3ng。因该技术存在灵敏度高、快捷、操作方便等特点逐渐成为热门研究领域。

1.3 原位杂交法（ISH）主要原理是人工合成大肠菌群DNA 或RNA 序列互补的探针，随后和大肠菌群行原位杂交，进而检出相对应大肠菌群，该方式目前用于含大肠菌群浓度低的饮用水检验，最多用荧光标记探针来进行荧光原位杂交。有关研究表示[13]，原位杂交技术具备简便、操作快速、安全、稳定等优势，且可进行定量分析，但其操作步骤繁琐，技术繁杂从而难以规模化推广。王建龙[14]研究中通过荧光标记探针取代同位素探针荧光原位杂交技术（FISH），并表示FISH 技术可以用于饮用水中大肠菌群的检测，且在较短时间内（6～8h）给出定量分析。

3 免疫学技术

3.1 酶联免疫吸附法(ELIsA)酶联免疫吸附法是1971年ENCVEIL 等建立在免疫酶基础上的一种新型免疫测定技术，是目前较为常用的一种检测手段。并有研究表示[15]其具有快速、简便等优点，但抗原和抗体浓度与反应液以及抗体特异性可产生影响。若污染物较严重且进行检测，ELISA 法存在严重缺陷，因其受到其他存在细菌影响而降低方法特异性。主要原理是利用酶标记抗体或酶标记抗原进行抗原抗体反应，酶和底物产生深浅不一颜色反应[16]。测定时酶标记在抗体分子上形成酶标抗体，在大肠菌群和酶标反应形成复合物之后，底物被酶催化，进而生成有色产物，其中，产物的量和样本待检验质的含量存在直接关系，故依据呈色深浅进行定量分析，其适于所有食品大肠菌群的检测[17]。

3.2 免疫磁珠技术（IMB）免疫磁珠技术以磁珠作为抗体载体，通过抗体抗原结合磁力作用下发生力学移动，进而达到分离特异性抗原目的。国外一学者使用改法从患者粪便中分离出多注山梨醇阳性O157:H7 大肠杆菌，表示该方式敏感度高，特异性好，且操作复杂，但不具备广泛使用能力。

4 小结

以往针对大肠菌群检测方式实验量大，步骤杂，且费时费力，以及灵敏度差等缺点，而近些年发展的大肠菌群快速检测方式包含PCR 法、酶联免疫吸附法等，有效解决了上述问题，但检测特异性、敏感性及操作上存在多种问题，故还未有一种真正达到成本低、灵敏度好、准确性高等检测方式，故仍需不断科学研究，寻找一种适宜的方式。