超声波协同半仿生法提取灵芝三萜工艺优化

马婧嘉 李雅茹 张文隽 郝 哲 屈文英 吴亚召 雷 萍*

（1陕西省微生物研究所，陕西西安 710043；2榆林市农垦服务中心，陕西榆林 719000；3洛川县农业机械技术服务中心，陕西延安 727400）

灵芝Ganoderma lucidum，又名神芝、万年蕈，现指隶属于真菌界、担子菌门、伞菌纲、多孔菌目、灵芝科的一类传统药用真菌的统称[1]。现有研究表明灵芝三萜在抗肿瘤[2]、肝脏保护[3]、免疫促进[4]等方面都发挥着显著作用，在食品和医药领域有广泛的应用。

目前，灵芝三萜的提取方法有超临界CO2提取、亚临界水提取、超声辅助提取、溶剂浸提、微波辅助提取法等[5]，这些传统提取法存在提取效率低、时间长、耗能高等缺点。半仿生提取法（semi−bionicex‐traction，SBE）是以控制论“灰思维方式”为基础的提取技术，可以提高药物生物利用度，从生物药剂学角度建立的一种新型提取技术[6−7]。超声波辅助提取法广泛应用于提取天然成分，其原理是利用超声波产生的空化、振动、粉碎、搅拌等综合效应，提高提取的效率[8]。目前，未见采用超声波协同半仿生法从灵芝中提取三萜类化合物的研究报道。因此，笔者以灵芝为原料，采取超声波协同半仿生法结合单因素与正交试验，探究三萜类化合物提取工艺，以期为灵芝三萜的提取提供一种新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝：灵芝−LG，由陕西省微生物研究所提供；熊果酸，河南标准物质研发中心；盐酸、无水乙醇、冰醋酸、氢氧化钠、香草醛、高氯酸、乙酸乙酯，天津市天力化学试剂有限公司（均为分析纯）。

1.2 仪器与设备

酸度计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；TU−1901 双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；JP−120ST 超声波清洗仪，深圳市结盟设备有限公司；TD5离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 灵芝粉的制备

新鲜灵芝子实体→洗净晒干→60 ℃烘箱干燥（至恒重）→粉碎→过40目筛→灵芝粉。

1.3.2 超声波协同半仿生法提取灵芝三萜

准确称取按照1.3.1 制备灵芝粉样品1 g，采用超声波协同半仿生法，固定料液比、乙醇质量分数、超声时间、提取温度4 个因素，在模拟人体胃、肠道环境pH 值为1、4、7.5、8.3的溶液中依次分别提取灵芝三萜，在 4 000 r/min 条件下离心 10 min，合并 3 次上清液，定容至100 mL，作为待用供试品溶液。

1.3.3 灵芝三萜的测定

采用香草醛−高氯酸比色法测定灵芝三萜[9]。

1.3.4 灵芝三萜提取率的计算

灵芝三萜提取率计算：灵芝三萜提取率（质量比）=C×V/m%

式中：C（mg/mL）表示提取液中灵芝三萜的质量浓度；V（mL）表示提取液定容体积；m（mg）表示所用灵芝干粉质量。

1.3.5 单因素试验设计

精确称取1 g灵芝粉5份，按1.3.2的方法进行超声波协同半仿生法提取灵芝三萜，分别设固定条件乙醇质量分数75%，料（g）液（mL）比为1∶25、提取温度60 ℃，超声时间20 min，分别设定5水平：料（g）液（mL）比为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35；乙醇质量分数为75%、80%、85%、90%、95%；提取温度40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃；超声时间 10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，考察不同因素对灵芝三萜的提取率影响。

1.3.6 正交试验

以上述单因素试验为基础，选取表1 中4 因素3水平，采取L9（34）正交试验对灵芝三萜的提取工艺参数进行优化。

李林，任校长19年来，他把“引导学生走向幸福”作为学校的办学宗旨，积极探索教育规律，努力实施“以德立校，依法治校，科研兴校，文化强校”的办学策略，着力培养学生适应终身发展和社会发展需要的必备品格和关键能力。

表1 正交试验因素水平

1.4 数据处理

用Office 软件处理数据，运用GraphPad Prism 7.00作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对灵芝三萜提取率的影响

由图1可知，随着料液比上升，灵芝三萜的提取率逐步提高，料液比为1∶30，灵芝三萜的提取率最高（2.71%）。可能加大溶剂的量后，增加了固相和液相之间三萜的含量差，加快三萜的溶出速率，从而提取率上升，当料液比达1∶30已充分溶出灵芝三萜，故料液比1∶30提取率最高。

图1 不同料液比下灵芝三萜提取率

2.1.2 乙醇质量分数对灵芝三萜提取率的影响

由图2 可知，乙醇质量分数为70%、80%、85%时，随着乙醇质量分数上升，灵芝三萜提取率逐渐升高，乙醇质量分数为85%时三萜提取率最高（2.85%），再继续提高乙醇质量分数，三萜的提取率反而降低。原因可能是过高的乙醇质量分数，导致其他醇溶性物质析出量增加，影响三萜类物质的溶出，因而三萜提取率不升反降。

图2 不同乙醇质量分数下灵芝三萜提取率

2.1.3 提取温度对灵芝三萜提取率的影响

由图3 可知，灵芝三萜提取率随着提取温度的升高逐渐上升，在提取温度60 ℃时灵芝三萜提取率最高（2.78%），再继续升高温度，提取率反而降低。可能过高提取温度使三萜发生了分解，破坏了三萜结构[10]，导致提取率降低。

图3 不同提取温度下灵芝三萜提取率

提取灵芝三萜需要一定的时间溶出有效成分并达到传质平衡。由图4可知，超声时间的延长，溶出的三萜增多，超声时间30 min，三萜的提取率最高（2.82%），随后三萜的提取率开始降低。这可能是因为溶出的无效成分和杂质增多，影响三萜类物质的溶出，因此超声时间30 min 为灵芝三萜类物质提取的最佳时长。

图4 不同超声时间下灵芝三萜提取率

2.2 超声波协同半仿生法提取灵芝三萜的工艺正交优化结果

正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 正交试验结果

表3 方差分析

由表2 和表3 可知，4 个试验因素对灵芝三萜的提取率均有不同程度的影响，其影响的主次顺序为：B（乙醇质量分数）>D（提取时间）>A（料液比）>C（超声温度）。乙醇质量分数对提取率的影响极为显著，提取时间对提取率影响显著，其余两个因素不显著。从R值得出的最佳工艺参数为A2B2C2D2，所对应的条件：料（g）液（mL）比为1∶30，乙醇质量分数为85%，提取温度60 ℃，超声时间30 min。与表2中的较优组合A2B2C3D1不一致。因此需要进一步验证试验（重复3次后取其平均值），结果见表4。

由表4 可知，超声波协同半仿生法提取灵芝三萜的最佳工艺参数为A2B2C2D2，经过3 次验证试验，灵芝三萜的平均提取率为2.99%，高于正交试验中的较优组合。

表4 正交试验验证结果

3 结论

试验首次采取超声波协同半仿生法提取灵芝三萜，考察了不同料液比、乙醇质量分数、超声时间、提取温度条件下灵芝三萜的提取率。单因素试验及正交试验结果表明，提取灵芝三萜的最佳工艺条件为料（g）液（mL）1∶30，乙醇质量分数85%，提取温度60 ℃，超声时间30 min。经过三次平行重复试验，灵芝三萜的提取率为2.99%，试验为灵芝三萜的提取提供了新的提取方法。