黄芩素通过抑制NF-κB通路对小鼠烧伤愈合的促进作用

徐俊涛， 王 莹， 马 飞， 王 丽， 方玉甫， 刘爱民

(1.河南省中医院皮肤科，河南 郑州 450002；2.中山大学第六附属医院新生儿科，广东 广州 510655)

烧伤是急救医学中最主要的疾病之一，严重烧伤可导致身体和心理上的伤疤和慢性残疾[1]，可引起一系列问题，包括坏死、创伤、成纤维细胞损伤、炎症、血液和淋巴毛细血管淤滞、胶原大量产生等[2]，当前治疗药物包括抗生素、消炎药、银盐，但具有多种缺点和不良反应[3]。黄芩素是一种黄酮化合物，最初来源于黄芩的根和黄芩苷的苷元[4]，具有广泛的生物活性，包括抗氧化、抗癌、抗炎症、神经保护作用[5]，能促进皮肤随机皮瓣存活[6]，但其在烧伤中的作用还有待进一步探究。NF-κB是一种转录因子，可调控多种细胞因子、趋化因子、黏附因子等的表达，在感染引起的免疫反应中起关键作用[7]。本研究旨在探究黄芩素对小鼠烧伤愈合的治疗作用，以及其涉及的主要机制。

1 材料

1.1 动物 8～12周龄雄性BALB/c小鼠购自成都达硕实验动物有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(川)2019-028。实验获得河南省中医院动物保护和使用委员会批准。

1.2 试剂与药物 胎牛血清(批号1237698)、DMEM(批号8128032)购自美国Gibco公司；膜联蛋白V-碘化丙啶(Annexin V-PI)双染凋亡试剂盒(批号20150314)购自美国BD公司；二甲基亚砜(DMSO，货号D8418)、黄芩素(纯度>98%，货号465119)、鼠源TNF-α重组蛋白(货号H8916)购自美国Sigma公司；CCK-8试剂盒(货号ab228554)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2，货号ab182858)、caspase-3(货号ab184787)、白介素-6(IL-6，货号ab229381)、白介素-1β(IL-1β，货号ab254360)、基质金属蛋白酶2(MMP-2，货号ab181286)、基质金属蛋白酶9(MMP-9，货号ab228402)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB，货号ab239882)、总NF-κB(t-NF-κB，货号ab207297)、β-actin(货号ab8227)抗体购自英国Abcam公司；磷酸化NF-κB抑制蛋白-α(p-IκBα，货号2859)、总IκBα(t-IκBα，货号4812)购自美国Cell Signaling Technology公司；所有二抗均购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 仪器 超净工作台(青岛海尔生物医疗股份有限公司)；CO2细胞恒温培养箱、酶标仪、流式细胞仪、高速冷冻离心机(美国Thermo公司)；凝胶成像仪(加拿大Carestream公司)；光学显微镜(德国Leica公司)。

2 方法

2.1 小鼠烧伤模型建立 雄性BALB/c小鼠用戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉，剃掉背部毛发，暴露皮肤，将预热到165 ℃的铜块(2 cm×2 cm，150 g)接触皮肤区域10 s(不对铜块施加额外压力，以确保使用相似压力造成每次烧伤)。将小鼠随机分为对照组，烧伤组，20、50 mg/kg黄芩素组，黄芩素(50 mg/kg)+TNF-α重组蛋白(5 μg/kg)组，每组8只，给药组小鼠每隔2 d腹腔注射相应剂量药物，持续14 d。在第0～14天，每隔2 d对创面进行拍照，由2名研究人员采用IPP 6.0软件对创面面积进行分析，并在第14天处死小鼠，计算伤口面积，公式为伤口面积=(残余创面面积/初始创面面积)×100%。

2.2 组织学分析 在烧伤第8天将小鼠处死，用组织剪沿烧伤创面边缘5 mm的位置取正方形组织块，厚度为皮肤全层，置于10%福尔马林缓冲液中固定至少24 h，梯度乙醇脱水后石蜡包埋，切成5 μm厚切片，脱蜡后进行苏木精-伊红(HE)染色，在光学显微镜(×100)下观察组织病理形态变化。

2.3 原代皮肤成纤维细胞制备及培养 小鼠剃毛后处死，置于75%乙醇中浸泡10 min，PBS冲洗3次，取背部皮肤，去除血管脂肪等多余组织，PBS冲洗3次，切成小块，加入0.05%胰酶消化液消化1 h，DMEM完全培养基终止消化，PBS清洗细胞悬液，均匀铺于细胞培养皿底部，并加入含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

2.4 细胞热刺激 将原代小鼠成纤维细胞置于热水器水箱中，在52 ℃下孵育30 s，随后放到正常环境中培养。

2.5 给药 细胞经热刺激后，分别用20、50 μmol/L黄芩素干预细胞48 h；或细胞经热刺激后，用50 μmol/L黄芩素、100 ng/mL TNF-α重组蛋白共同干预细胞48 h。

2.6 细胞凋亡检测 按“2.5”项下方法给药48 h后，PBS清洗细胞3次，重悬于含Annexin V-FITC、PI各10 μL的结合缓冲液中，室温避光孵育15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，实验重复3次。

2.7 细胞增殖检测 将原代皮肤成纤维细胞以每孔1×104个细胞的密度接种至96孔板，按“2.5”项下方法给药，在正常条件下分别培养12、24、48、72 h，随后在每孔加入10 μL CCK8试剂并混匀，继续培养4 h，采用酶标仪检测细胞在450 nm波长处的光密度(OD)值，计算增殖率，实验重复3次。

2.8 Western blot检测蛋白相对表达 采用RIPA裂解液提取细胞或组织中的蛋白，取20 μL进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(10%)电泳(120 V，2 h)，电转法将蛋白转至聚偏氟乙烯膜(250 mA，2 h)，10%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗在4 ℃下过夜孵育，加入二抗室温孵育2 h。采用凝胶成像仪曝光蛋白条带，Image-Pro Plus软件分析条带灰度值，实验重复3次。

3 结果

3.1 黄芩素抑制热刺激对小鼠皮肤成纤维细胞凋亡、增殖和炎症因子的作用 如图1所示，与对照组比较，皮肤成纤维细胞受热刺激后，细胞增殖率、抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01)，细胞凋亡率升高(P<0.01)，促凋亡因子caspase-3、炎症因子(IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9)蛋白表达升高(P<0.01)；与热刺激组比较，20、50 μmol/L黄芩素处理能增加细胞增殖能力以及Bcl-2蛋白表达(P<0.05，P<0.01)，抑制细胞凋亡(P<0.05，P<0.01)，降低caspase-3、IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05，P<0.01)。

注：A～B为细胞凋亡情况，C为细胞增殖能力，D～F为细胞凋亡相关蛋白表达，G～K为细胞炎症相关蛋白表达。与对照组比较，**P<0.01；与热刺激组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 黄芩素抑制热刺激诱导的NF-κB通路 如图2所示，与对照组比较，皮肤成纤维细胞受热刺激后，p-NF-κB、p-IκBα蛋白表达升高(P<0.01)；与热刺激组比较，20 、50 μmol/L黄芩素能抑制p-NF-κB、p-IκBα蛋白表达(P<0.05，P<0.01)。

注：A为细胞蛋白条带图，B～C为细胞p-NF-κB、p-IκBα蛋白相对表达量。与对照组比较，**P<0.01；与热刺激组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.3 黄芩素通过NF-κB通路抑制热刺激对小鼠皮肤成纤维细胞凋亡、增殖和炎症因子的作用 与热刺激组比较，50 μmol/L黄芩素处理能抑制细胞凋亡(P<0.05)，下调p-NF-κB、p-IκBα、caspase-3、IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9蛋白表达(P<0.05)，增加细胞增殖和Bcl-2蛋白表达(P<0.05)；与50 μmol/L黄芩素组比较，100 ng/mL TNF-α(NF-κB通路激活剂)重组蛋白处理可逆转黄芩素的作用，见图3。

注：A～C为细胞NF-κB、IκBα蛋白表达，D～E为细胞凋亡率，F～H为细胞凋亡相关蛋白表达，I为细胞增殖能力，J～N为炎症相关蛋白表达。与对照组比较，**P<0.01；与热刺激组比较，#P<0.05；与50 μmol/L黄芩素组比较，$P<0.05。

3.4 黄芩素通过NF-κB通路促进小鼠烧伤恢复 与烧伤组比较，50 mg/kg黄芩素干预能促进烧伤愈合(P<0.05)，5 μg/kg TNF-α则抑制50 mg/kg黄芩素对创面愈合的促进作用(P<0.05)。在烧伤后第8天，烧伤组表皮结构不完整，明显增厚，表皮附近细胞数较其他2组减少，并观察到瘢痕形成；50 mg/kg黄芩素组有少量毛囊形成，纤维组织排列较整齐，开始形成较完整的表皮；50 mg/kg黄芩素和5 μg/kg TNF-α共处理组表皮附近细胞数较烧伤组增多，表皮厚度较黄芩素组厚。与对照组比较，烧伤组织中IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表达升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01)；与烧伤组比较，20、50 mg/kg黄芩素干预能降低烧伤组织中IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表达(P<0.05，P<0.01)，升高Bcl-2蛋白表达(P<0.05，P<0.01)；与50 mg/kg黄芩素组比较，5 μg/kg TNF-α处理能升高IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9、caspase-3蛋白表达(P<0.05)，降低Bcl-2蛋白表达(P<0.05)。见图4。

注：A为烧伤面积统计，B为烧伤组织HE染色(×100)，C～I为细胞凋亡和炎症相关蛋白表达。与对照组比较，**P<0.01；与烧伤组比较，#P<0.05，##P<0.01；与50 mg/kg黄芩素组比较，$P<0.05。

4 讨论

烧伤至今仍是世界上导致死亡和残疾的重要原因之一，其愈合过程是现代医学的一大挑战。尽管先进的临床护理技术使烧伤病人死亡率有所下降，但仍面临许多问题，如烧伤感染、伤口愈合延迟和肥厚性瘢痕形成等[8]。传统中药具有副作用小，成本低的优势，已被选作烧伤治疗的替代药物或辅助药物[9]。

皮肤成纤维细胞是组成皮肤真皮的主要结构成分，是伤口愈合过程中最重要的细胞成分之一，它们通过增殖、迁移、胶原形成和细胞因子分泌影响皮肤功能[10-11]。正常情况下，皮肤成纤维细胞维持一定的增殖和代谢速率，并分泌一定量的基质和细胞因子以维持皮肤完整性和正常代谢。然而，在烧伤等环境压力下，成纤维细胞表现出异常行为，包括增殖速度加快，炎性细胞因子分泌和细胞外基质产生增多[12]。本研究中，小鼠原代皮肤成纤维细胞受热刺激后，细胞凋亡增加，细胞增殖能力降低，且促炎性细胞因子(IL-6、IL-1β、MMP-2、MMP-9)分泌增加。此外，热刺激还可激活皮肤成纤维细胞中NF-κB信号通路。

黄芩素具有抗炎和抗氧化作用。Lin等[6]发现，黄芩素能促进皮肤随机皮瓣存活，这与增强血管生成，减少氧化应激和细胞凋亡有关。黄芩素通过影响Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号刺激血管生成，通过增强抗氧化因子活性抑制氧化应激，通过调节磷酸肌醇三激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号抑制细胞凋亡[13-14]。NF-κB转录因子控制多种生理过程，包括炎症、免疫、细胞凋亡、细胞增殖和血管生成[15]。黄芩素通过抑制NF-κB转录激活发挥抗炎作用[16]。研究表明，TNF-α在体内外均能很好地激活NF-κB,可以作为NF-κB信号通路的阳性激活剂。本研究显示，20、50 μmol/L黄芩素干预均可逆转热刺激诱导的皮肤成纤维细胞凋亡增加，增殖减少，炎性细胞因子分泌增加，NF-κB通路激活；而100 ng/mL TNF-α重组蛋白干预逆转了黄芩素对热刺激诱导的细胞损伤的保护作用，提示黄芩素发挥其功能主要通过抑制NF-κB信号通路活性。

研究表明，多种传统中药对小鼠烧伤愈合具有促进作用，如石榴皮提取物促进大鼠深度二级烧伤创面愈合，具有较强抗菌活性[17]。黄芩素已被报道在促进成纤维细胞胶原合成中发挥重要作用[18]。此外，黄芩素可通过抑制转化生长因子-β/Smad2/3信号传导途径减轻肥厚性瘢痕的形成[19]。本研究显示，50 mg/kg黄芩素腹腔注射能降低烧伤组织中炎性细胞因子和促凋亡因子蛋白表达，升高抗凋亡因子表达，且可促进小鼠烧伤伤口愈合；而5 μg/kg TNF-α重组蛋白腹腔注射则抑制了黄芩素对烧伤愈合的促进作用，提示黄芩素主要通过抑制NF-κB信号通路促进小鼠烧伤恢复。

综上所述，黄芩素可通过抑制NF-κB信号通路，缓解热刺激对原代小鼠皮肤成纤维细胞的损伤，促进小鼠烧伤愈合。