血红素加氧酶1对肝缺血再灌注损伤的细胞保护机制进展

杨轶涵，展希，方育

(昆明医科大学第一附属医院麻醉科，昆明 650032)

在临床工作中，肝部分切除术、肝移植、休克、严重创伤等治疗后会不可避免地发生肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI)，它是术后肝功能障碍和移植后器官排斥的主要原因[1]。在HIRI的病理生理机制中，肝细胞、库普弗细胞、肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)等发挥重要作用。在肝脏缺血阶段，肝组织内细胞线粒体功能障碍和酸性代谢产物积累干扰了细胞的主动跨膜转运，最终导致肝细胞发生水肿甚至坏死。恢复肝脏血流即再灌注时，在线粒体氧化磷酸化功能障碍的基础上免疫介导的库普弗细胞被激活，两者共同产生大量活性氧使氧化应激和炎症级联反应增强，故肝脏血流恢复后加重了组织损伤[2]。同时，LSEC可表达黏附分子和趋化因子，引起肝脏微循环障碍，进一步加重HIRI。目前，缺血预处理、缺血后处理、针对HIRI病理生理机制和靶点的药物治疗、机械灌注是治疗HIRI的主要策略，虽然这些方法的保护作用已在动物研究中得到验证，但在临床应用和疗效方面还存在争议[3]。因此，全面了解HIRI潜在的机制和作用靶点可有效改善肝脏损伤，达到更好的治疗效果。有研究表明，血红素加氧酶(heme oxygenase，HO)-1上调对改善HIRI起重要保护作用，但HO-1在肝脏中的表达调控复杂，不同肝脏细胞类型可能通过一条或多条信号通路触发HO-1基因的表达[4-6]。目前HO-1对这些细胞的保护机制尚未完全明确，而通过深入研究HIRI的机制来改善术中HIRI的治疗方案成为目前研究的主要方向。现主要阐述在HIRI中HO-1发挥选择性细胞保护作用的相关机制及进展。

1 HO-1的生物学特性

HO是体内血红素分解代谢的限速酶，能将游离血红素分解成一氧化碳、游离铁和胆绿素。目前已鉴定出3种哺乳动物源性HO异构体，一种为诱导型同工酶HO-1，可提供针对氧化应激的保护，另外两种组成型表达同工酶为HO-2和HO-3，HO-2主要在脑和睾丸中表达，HO-3则在组织中表达较低[7]。在稳态条件下，除脾脏和肝脏的巨噬细胞以及一些耐受性免疫细胞外，HO-1在大多数细胞和组织中低表达或不表达。在应激条件下，HO-1的诱导则是细胞免受损伤的适应性保护机制，HO-1基因的表达存在多个转录调控因子，主要与氧化还原敏感转录因子、核转录因子红系2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)、细胞应激反应相关的蛋白激酶通路[如p38促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、c-Jun氨基端激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)]有关[7-8]。因此，HO-1的特性决定其成为目前研究的一个主要方向，HO-1及其产物在心、脑、肝、肾等器官保护方面均有文献报道，可发挥抗氧化应激、抗炎、抗凋亡、免疫调节等作用。Nakamura等[9]也证明了在人类肝移植术后移植物部位HO-1水平与原位肝移植患者的临床结局相关，低水平的HO-1伴随患者肝功能的恶化和生存率降低。

2 HO-1在HIRI中的细胞保护机制

2.1HO-1对巨噬细胞的保护机制

2.1.1巨噬细胞与HIRI 肝脏巨噬细胞是HIRI中免疫反应的关键，巨噬细胞分为组织驻留巨噬细胞(称为库普弗细胞)和血液/骨髓源性巨噬细胞(称为循环血液的单核细胞)。在肝脏健康状态下，库普弗细胞是肝脏适应性免疫耐受反应的中心，主要负责清除流经肝脏循环血液中的抗原，将它们呈递给调节性T细胞，诱导耐受性T细胞反应并产生免疫抑制细胞因子(如白细胞介素-10)，使肝脏保持免疫耐受[1,10]。HIRI时，邻近损伤肝细胞释放的损伤相关分子模式通过模式识别受体(如Toll样受体、清道夫受体)激活库普弗细胞，激活的库普弗细胞即从免疫耐受状态转化为具有免疫活性的表型，从循环中招募中性粒细胞和炎性单核细胞，分泌多种促炎性细胞因子导致组织损伤[11-12]。其中，库普弗细胞对抗免疫反应耗竭后可通过骨髓单核细胞再生[13]。因此，肝巨噬细胞在HIRI中具有促炎和抗炎的双重作用。

2.1.2HO-1调控巨噬细胞分化为抗炎表型 HIRI时激活的库普弗细胞可以极化为促炎M1型和抗炎M2型两种亚型，而HO-1的表达促进巨噬细胞沿抗炎途径即支持M2表型来保护HIRI。在肝脏缺血再灌注模型中，骨髓特异性HO-1基因敲除小鼠表现为M1标志物增加而M2标志物减少的表达模式，HO-1转基因小鼠则呈相反趋势，并减轻肝脏炎症细胞浸润和损伤，说明HO-1过表达驱动巨噬细胞向M2型分化[14]。其机制可能与Nrf2有关，Nrf2是抗氧化应激和抗炎的关键调节因子，肝脏缺血再灌注应激能增加Nrf2活性，促使Nrf2转移至细胞核与HO-1基因启动子上游的顺式抗氧化反应元件结合，上调HO-1的表达，并促进巨噬细胞向M2型分化，减轻氧化应激介导的炎症，改善小鼠的HIRI[15-16]。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)/p53信号通路也可能是HIRI中巨噬细胞HO-1发挥抗炎功能的基础，HO-1可促进SIRT1的表达，从而保护p53免受泛素化，增强p53信号通路以抑制巨噬细胞的激活，减少促炎性细胞因子的释放，同时促进抗炎性细胞因子白细胞介素-10和转化生长因子-β产生，减轻肝脏的炎症反应[9]。此外，HO-1的产物一氧化碳能通过稳定缺氧诱导因子-1α上调转化生长因子-β，介导巨噬细胞抗炎表型的产生[17]。由此认为，HO-1活性是调控巨噬细胞分化和抑制“炎症”巨噬细胞群所必需的。

2.1.3髓系HO-1介导的自噬、抗凋亡作用 在人类原位肝移植中，骨髓源性巨噬细胞产生的HO-1可协调肝细胞产生SIRT1介导自噬[18]。自噬是对损伤的一种适应性细胞应激反应，当细胞受到应激如缺血缺氧时自噬被激活，从而降解清除受损或功能异常的细胞器以维持细胞稳态，巨噬细胞HO-1通过SIRT1调控肝细胞自噬的具体机制尚不清楚，可能通过SIRT1/p38信号通路激活AMP活化的蛋白激酶磷酸化，从而促进HO-1调控自噬[9,19]。另一方面，作为肝脏HO-1的主要来源，巨噬细胞也适合作为HO-1基因转移的细胞传递系统，在HIRI时HO-1转染的骨髓源性巨噬细胞会优先迁移到缺血组织，显著增加缺血肝脏的HO-1、上调抗凋亡因子Bcl-2的表达并抑制胱天蛋白酶3的活性，从而抑制肝细胞和LSEC凋亡，减轻肝脏损伤[20]。

因此，巨噬细胞表达的HO-1对HIRI具有重要保护作用，是抗炎、抗凋亡、诱导自噬的主要介质，HO-1转染的骨髓源性巨噬细胞传递系统能在缺血再灌注应激肝脏中发挥靶向治疗基因的作用。HO-1针对巨噬细胞的治疗策略旨在调节库普弗细胞激活和调控巨噬细胞极化，未来肝移植受者可以在术前或术后使用药物诱导HO-1表达，或在体外进行基因操作使HO-1过表达，也可通过输注外源性“抗炎”巨噬细胞群以减轻HIRI。

2.2HO-1对LSEC的保护机制

2.2.1LSEC与HIRI LSEC分布于红细胞和肝实质细胞之间的肝窦毛细血管内皮上，具有不连续结构(即“窗孔”区域)，LSEC在调节肝血窦血流、清除废物、细胞因子分泌和呈递抗原方面发挥重要作用[21]。以往研究主要强调LSEC对慢性肝病中肝纤维化的作用机制，近年研究发现LSEC与HIRI早期微血管功能障碍密切相关，受损后的LSEC分泌一氧化氮减少，内皮素表达增加，一氧化氮/内皮素表达平衡失调，导致血管舒张和收缩功能受损，激活LSEC表达血管黏附因子和P选择素，促进血小板黏附于LSEC，进一步诱导LSEC凋亡，并且再灌注后血流的机械牵拉诱导LSEC释放趋化因子，招募中性粒细胞，而中性粒细胞与血小板的相互作用可形成中性粒细胞外诱捕网，上述微环境的改变共同引起肝微循环充血和血栓形成[22-23]，且LSEC对再灌注后的应激反应比库普弗细胞和肝细胞更敏感，被作为早期HIRI的观察靶点[24]。因此，早期LSEC结构与功能的改变是构成HIRI的病理生理基础，正常的LSEC功能对于保护HIRI非常重要。

2.2.2HO-1有助于维持正常的LSEC表型 LSEC“窗孔”的维持主要依赖于自身分泌的一氧化氮，这种LSEC血管内分泌保护效应的机制与Krüppel样因子2(Krüppel-like factor 2，KLF2)有关，KLF2是肝脏血管内皮表达的一种血管内皮保护因子，血流剪切力是刺激KLF2表达的重要因素[25]。大鼠肝移植手术阻断肝血流时，KLF2及其靶基因内皮型一氧化氮合酶和HO-1的表达减少，再灌注时，血流剪切力刺激KLF2过表达，促使Nrf2的核易位，KLF2通过Nrf2/HO-1通路抑制内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶解偶联，从而产生一氧化氮，以维持LSEC表型[26-27]。KLF2还能通过HO-1介导的自噬增加急性肝损伤早期LSEC的自噬通量，自噬可以通过去除氧化物质控制LSEC中的抗氧化反应，从而改善受损LSEC的细胞活力并增加一氧化氮水平，防止肝损伤进展[28]。由此，HO-1可作为一种中间物质促进一氧化氮的产生，从而维持正常的LSEC表型。

2.2.3HO-1改善肝窦内微循环障碍 HO-1改善HIRI后的肝窦内微循环障碍的作用机制主要是减少LSEC凋亡、抑制肝窦内LSEC与血小板黏附、抑制血小板聚集。Qu等[29]提出了HO-1在HIRI期间对LSEC的保护作用，用HO-1腺病毒感染体外培养的小鼠LSEC，发现过表达HO-1可以抑制促炎因子释放，并通过减少LSEC凋亡显著提高其存活率，HO-1转染的骨髓间充质干细胞释放的外泌体也能有效减少炎症损伤所致的LSEC凋亡[30]。HO-1还能强化骨髓间充质干细胞的功能，促进其分化为内皮细胞，进一步加强LSEC增殖，HO-1通过LSEC调节一氧化氮/内皮素平衡降低肝窦内血管阻力，从而改善肝移植后大鼠肝窦微循环，保护和修复移植后肝脏[31-32]。另一方面，HO-1过表达还可减少HIRI中血小板与LSEC、库普弗细胞之间的黏附，HO-1的产物一氧化碳也具有舒张血管和抑制血小板聚集的作用，血小板聚集是一个需要能量的过程，一氧化碳通过抑制血小板中ATP生成的两条主要途径，即抑制线粒体呼吸中的细胞色素C氧化酶和糖酵解中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸耗竭，同时损害血小板生物能，从而有效抑制血小板聚集、增加血小板在肝窦内的流速，改善受损肝脏的肝功能和微循环障碍[33-34]。

因此，过表达HO-1可调节HIRI的微循环障碍，如维持LSEC表型、减少血小板黏附，从而改善再灌注后肝窦的血流流速等。目前HO-1对LSEC的作用机制研究较少，而保护LSEC免受损伤的治疗策略是减轻HIRI的关键之一，通过HO-1来靶向保护LSEC可能是未来的研究方向。

2.3HO-1对肝细胞的保护机制

2.3.1肝细胞与HIRI 肝细胞是肝脏的中心代谢功能细胞，大多数肝脏特异性功能(如脂质代谢、血浆蛋白合成和解毒)主要由肝细胞执行。在肝脏缺血再灌注期间，肝细胞的呼吸链由于缺氧、营养物质输送受损和ATP耗竭而中断，细胞呼吸链的破坏导致线粒体功能障碍，肝细胞受损。再灌注过程中，肝组织再氧合并不会恢复细胞正常的呼吸链功能，而是在线粒体功能受损和肝细胞损伤相关分子模式释放的基础上加剧活性氧的产生，从而激活炎症级联反应，导致肝细胞再次受损[35]。在肝移植手术中，已通过低温保存移植肝(即冷缺血)来减少其代谢过程中ATP的正常需求，对肝细胞具有保护作用，肝细胞在冷缺血期可能不受影响，但在再灌注期会出现大量的肝细胞凋亡[24]，这些坏死的肝细胞可能进一步引起微循环障碍，形成恶性循环，肝组织缺血性凝固性坏死，最终导致肝衰竭，故探索对肝细胞的特异性保护机制尤为必要。

2.3.2HO-1减轻肝细胞氧化应激 HIRI中肝细胞受损的主要原因之一是活性氧过量产生，导致氧化/抗氧化稳态失衡，而HO-1在肝细胞氧化应激过程中起重要作用。Brahma相关基因1是染色质重构的主要因子，参与保护氧化应激诱导的DNA损伤和调节氧化还原稳态。氧化应激时Nrf2与Brahma相关基因1相互作用促进Z-DNA即左手双螺旋DNA形成，随后Z-DNA招募RNA聚合酶Ⅱ到HO-1启动子，在HO-1启动子上形成Brahma相关基因1/Nrf2复合物，Brahma相关基因1显著增加Nrf2与HO-1启动子之间的募集，激活抗氧化酶HO-1基因在肝细胞中的转录，从而提高HO-1的转录效率，有效减轻肝脏氧化应激所致的肝细胞损伤[36-37]。近年研究发现，天麻素预处理能通过p38 MAPK/Nrf2/HO-1信号通路改善氧化应激和炎症反应，防止肝细胞凋亡，从而减轻HIRI[38]。

2.3.3HO-1介导肝细胞自噬 自噬在肝细胞线粒体稳态过程中起重要作用，自噬的激活作为一种保护性手段可防止肝细胞早期凋亡变化。在HIRI早期阶段，HO-1可增强受损肝细胞线粒体自噬，减少线粒体DNA释放活性氧，减轻损伤相关分子模式诱导的炎症反应和随后的二次损伤。Liu等[39]发现黄芩素预处理可减轻大鼠肝细胞的缺血再灌注损伤，其保护作用依赖于HO-1介导的自噬。HO-1能通过PI3K/Akt信号通路和p38/MAPK信号通路促进Beclin-1形成，Beclin-1是一种自噬相关蛋白，参与早期阶段的自噬体形成，HO-1诱导使自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3和Beclin-1的水平显著提高，从而促进肝细胞自噬，吞噬受损线粒体，抑制肝细胞凋亡[40-41]。自噬阻止细胞凋亡的机制可能与Beclin-1的C端有关，Beclin-1的C端可以放大线粒体介导的细胞凋亡作用[42]。此外，肝细胞内钙超载和钙蛋白酶系统激活可能是HIRI中自噬受损的主要原因，HO-1诱导的自噬还可以通过抑制钙依赖性钙蛋白酶2信号通路来调控，在缺血再灌注前用HO-1诱导剂预处理能以浓度依赖的方式降低肝细胞内钙蛋白酶2水平，且HO-1处理的肝组织显示大量的自噬空泡，出现了选择性的线粒体自噬，使受损的线粒体被清除[43-44]。因此，HO-1通过诱导肝细胞自噬介导了强大的细胞保护作用。

2.3.4HO-1抑制肝细胞凋亡 HO-1具有抗肝细胞凋亡作用的主要机制在于激活核因子κB和调控凋亡蛋白。有研究证明，低水平的活性氧可以触发细胞适应性反应和生存，PI3K/Akt通路的激活也被认为是活性氧信号通路触发的自适应信号通路[45]。HO-1的产物一氧化碳能产生低水平的活性氧，使Akt磷酸化，活性氧信号通路和Akt磷酸化共同促进核因子κB的激活，以阻止肝细胞凋亡[46]。另一方面，肝细胞受损后促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白会易位至线粒体，导致胱天蛋白酶3活化引起线粒体凋亡，而一氧化碳可通过激活p38 MAPK通路抑制Bcl-2相关X蛋白向线粒体转运，并提高抗凋亡分子(如Bcl-xL、Bcl-2)的表达，从而抑制肝细胞凋亡[47]。

综上，HO-1及其产物一氧化碳可通过不同机制对肝细胞提供抗氧化应激、促进自噬、抗凋亡的细胞保护作用。近年研究发现，人类抗原R能作为HO-1的调节剂，通过自噬稳定HO-1的信使RNA，在人类肝移植中发挥肝细胞保护作用[48]。大鼠肠道短暂性缺血预处理也能在肝细胞中诱导大量HO-1，为之后的HIRI提供保护作用[49]。因此，给予HO-1诱导剂、人类抗原R、无毒浓度的一氧化碳等治疗措施可能从多方面改善肝脏疾病的发展，促进HIRI后患者的快速恢复。

3 小 结

HIRI是一个涉及多细胞、多分子、多信号通路的复杂过程，随着研究的逐渐深入，明确调节基因与精准靶向细胞尤为重要。近年来，纳米药物传递系统已被用于生物医学，通过设计纳米颗粒的大小、所带电荷及特定配体，有助于识别肝脏细胞上的细胞靶标或其受体，可在所需肝脏缺血再灌注损伤区域将HO-1抗炎及抗氧化药物靶向递送和可控释放[50]，实现细胞选择性给药，并增加药物疗效和安全性。因此，基于HO-1基因的靶向细胞疗法与纳米技术相结合的治疗策略可能成为未来治疗肝损伤的一种新方式，对改善实体器官移植具有很大潜力。