麦秸秆配施沼液或化肥对梨产量及土壤细菌群落的影响

贾义平， 沈俊俊， 姚 静， 刘 威， 高 静， 李翠玲*， 樊祜卿

(1.菏泽市动物疫病预防控制中心， 山东 菏泽 274000; 2.菏泽市畜牧工作站， 山东 菏泽 274000)

梨是我国种植范围最广的果树之一，仅次于苹果、柑橘。据统计，2017年我国梨树栽培面积和总产量分别占世界总栽培面积和产量的70%左右，是农民经济收入的重要来源之一[1]。近年来，果农为增收而盲目追求产量，化肥滥施现象普遍存在，导致土壤生态破坏、养分失衡、抗逆性下降。

秸秆富含丰富的有机碳以及氮、磷、钾、硅等农作物生长所必需的营养元素，可作为土壤微生物和作物的最初氮源[2]。秸秆还田能够提高氮磷钾的有效性和流动性，改善土壤供肥能力，促进作物养分吸收，具有一定增产作用[3]。前人研究发现[4-6]，秸秆的添加有利于梨树果实生长发育，加速梨树果实生长，增大果实体积，提高单果质量，提升果实品质。沼液是畜禽粪便、作物秸秆等厌氧发酵产生的终端产物之一，富含果实生长的氮磷钾、氨基酸、维生素等养分，是一种缓速兼备的液体有机肥[7-8]。有研究发现[9-10]，喷施沼液可提高叶片光合作用，显著增加梨果叶片长度、叶面积和百叶鲜重，提高产量，改善果实品质，增产效果明显。

探索秸秆配合有机无机肥如沼液来代替全化肥施肥，对当地梨产业合理施肥具有重要意义。而秸秆还田和沼液的施入，是否会给土壤环境带来不利影响，是必需关注的问题。细菌是土壤微生物中数量最丰富、分布最广泛的类群，参与氮磷循环、土壤矿化和养分吸收等过程，对土壤生态系统稳定、健康状况、保持土壤肥力与植物的生长发育具有重要影响[11]。本研究通过设置等氮的不同处理，即麦秸秆与化肥、沼液肥的组合，旨在分析秸秆配施沼液、化肥对梨树果实质量、土壤细菌群落的影响，为秸秆还田、沼液施用、化肥减量等农艺措施提供理论基础，为实现当地梨产业的绿色可持续发展提供理论依据与技术支撑。

1 材料和方法

1.1 自然概况

田间试验地位于菏泽市，黄河冲击平原，地势平坦，年平均气温13.7℃，年降水量平均625 mm,年平均无霜期210 d。果区面积0.43 hm2。试验品种为“黄冠”梨，树龄15 a，株行距4 m×4 m，梨树生长基本情况见表1。试验地土壤为潮土，基本性状：有机质15.42 g·kg-1，碱解氮101.99 mg·kg-1，有效磷23.97 mg·kg-1，速效钾162.22 mg·kg-1，pH值8.1。

表1 试验区梨树生长基本情况

1.2 试验设计

挑选生长正常、树势一致的梨树作为试验材料。供试沼液取自当地养殖场，经处理后施用[12]。沼液理化性质：有机质36.50 g·kg-1，全氮0.84 g·kg-1，全磷1.42 g·kg-1，有效钾1.68 g·kg-1，pH值8.0。麦秸秆经收割机打碎处理，并充分腐熟后粉碎，腐熟后麦秸秆理化性质(质量分数)总碳46.37%，总氮1.63%，碳氮比28.45，总磷0.89%，总钾1.03%。当地常规施化肥为15%-15%-15%的NPK 酸性复合肥，施氮量(230 kg·hm-2，以N计)。试验共设置5个处理，每个处理3次重复，每次重复区挑选10颗树，各处理的施氮量一致，完全随机区组排列。各处理如下： 1)对照组(不秸秆还田，不施沼液，不施化肥，记为CK)； 2)化肥处理组(100%化肥N，记为CF)； 3)秸秆+化肥处理(30%秸秆N，70%化肥N，记为S-CF)； 4)秸秆+沼液处理(30%秸秆N，70%沼液N，记为S-BS)； 5)沼液组(100%沼液N，记为BS)。所有处理分3次同时期施入树冠周围：萌芽期、第1次果实膨大期、第2次果实膨大期，各时期施氮量分别是总量的30%、40%、30%。其他田间管理措施参照当地常规农艺管理措施。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 果实样品测定

在各重复处理区随机采集梨树的4个方向25个果实，组成混合样带回，用电子天平测定单果质量，用游标卡尺测量果实的横纵径，计算果形指数。

1.3.2 土壤总DNA提取

在各重复处理区选取10个样点，采集土壤，去除其中的杂物、砂砾等，混匀，过2 mm筛。使用MoBio PowerSoil®DNA isolation kit试剂盒提取样本总DNA，各混合样品DNA提取物放于-20℃保存以备后续使用[13-14]。

1.3.3 特异区域扩增及测序

微生物多样性检测选取细菌 16S rDNA V3-V4区，DNA 样本送至南京集思慧远生物科技有限公司，正向扩增引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR反应体系：总体系25 μl：10 μl 2×EasyTaq PCR SuperMix(Transgen Bio, Inc)、正反向引物各1 μl 、土壤微生物DNA 10 ng，最后加dd H2O补至25 μl。反应参数：94℃5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸8 min。利用 Illumina Novaseq PE250高通量测序平台测序[13-14]。

1.4 数据处理及统计分析

采用Excel 2016和SPSS 22.0软件进行统计分析，对各处理组各项指标结果进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，使用邓肯(Duncan)新复极差来分析各相关变量，显著水平p<0.05。微生物群落分析中，数据采用 QIIME(v1.8.0)软件进行拼接、过滤，得到有效数据。然后基于有效数据进行OTUs(Operational Taxonomic Units，OTU相似性97%)聚类和物种分类分析。对比silva数据库(细菌)，得到物种分类信息，利用QIIME软件(v1.8.0)进行阿尔法(Alpha)多样性分析[13-14]。

2 结果与分析

2.1 麦秸秆配施沼液和化肥对梨果产量及果形指数的影响

由表2可知。与对照CK组相比，施肥处理组单果质量和实际产量均增加。单果质量和实际产量CF组增加最高分别为11.67%、10.18%，其次为S-CF组10.06%、9.46%，S-BS组8.03%、8.37%，差异显著(p<0.05)。含化肥组CF、S-CF单果质量均高于含沼液组S-BS、BS，均无显著差异(p>0.05)。各处理组果形指数无显著差异(p>0.05)。

表2 不同处理对梨果产量及果形指数的影响

2.2 麦秸秆配施沼液和化肥对土壤中细菌群落多样性的影响

由表3可知，各处理样本中细菌覆盖率(Coverage)指数均接近100%，说明样本序列中未被检测出的概率低，可反映出所测样本中细菌的真实情况。不同施肥处理土壤样品中细菌数为4572～5426，大小依次为CF>S-BS>S-CF>CK>BS(p<0.05)。使用α多样性指数(Chao1、Shannon、Simpson)来评估各处理土壤样本中细菌群落的物种多样性和丰富度的差异。chao1指数表明：S-CF>S-BS>CF>CK>BS(p<0.05)。shannon指数表明：S-CF>S-BS>CF>CK>BS(p<0.05)。simpson指数表明：BS>CK>CF>S-CF>S-BS(p>0.05)。α多样性分析结果表明，秸秆配施沼液或化肥可提高土壤细菌的生物多样性。

表3 不同处理对土壤细菌多样性指数的影响

2.3 麦秸秆配施沼液和化肥对土壤细菌群落组成的影响

在纲水平上，将相对丰度<0.1% 的类群归类为其他。由图1可知，共得到20个类群，有7个主要的细菌种群占所有序列的多数(64.14%～70.67%)。其中α、γ和δ-变形菌纲(Alphaproteobacteria，Gammaproteobacteria，Deltaproteobacteria)占38.18%～46.45%，是土壤中丰度最大的优势菌纲，在BS处理相对丰度最高为46.45%，CK处理相对丰度最低为38.14%。拟杆菌纲(Bacteroidia)在BS处理相对丰度最高为13.03%，S-CF处理最低为7.27%。厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、放线杆菌纲(Actinobacteria)在S-CF处理相对丰度最高，分别为7.99%、4.81%，在BS处理组最低，分别为5.09%、3.76%。酸杆菌纲(Subgroup 6)在CK处理相对丰度最高为7.31%，BS处理相对丰度最低为2.34%(见表4)。

图1 土壤样品中细菌类群纲水平分布图

表4 土壤样品中主要细菌类群纲水平相对丰度

3 讨论

3.1 麦秸秆配施沼液和化肥对梨果产量的影响

秸秆还田腐解可以改善土壤结构、保持土壤水分、促进氮素矿化、提高氮素利用率[15-16]。前人研究发现[4-6]，秸秆添加可以促进梨果实生长、增大果实体积、提升果实品质。沼液被视为是一种良好的有机肥料，合理施用能显著改良土壤，提高产品产量和品质。研究发现[9]，喷施沼液可提高叶片光合作用，提高产量，改善果实品质。还有研究结果表明[10]，根施沼液能显著增加梨果叶片长度、叶面积和百叶鲜重，增产效果明显。本研究发现，全化肥处理提升梨果产量效果最为明显，其次为秸秆配施化肥处理、秸秆配施沼液处理，三者之间无明显差异。这说明了秸秆配施沼液和化肥能够改良土壤、提高土壤肥力，达到全化肥的增产效果。全沼液处理对梨果产量的提高作用稍低于其他施肥处理，这可能与沼液富含的砷、汞、镉等重金属含量对植物生长及土壤环境产生了不利影响有关[17]。

3.2 麦秸秆配施沼液和化肥对土壤细菌群落的影响

土壤中细菌是土壤微生物种数量丰富、分布广泛的微生物类群，是驱动土壤有机物质和养分转化与循环的主要动力，反映了土壤质量、肥力及作物生长的情况[18]。绝大多数土壤中细菌种类基本相同，从纲水平分析来看，本研究各处理组土壤中变形菌纲、拟杆菌纲、放线菌纲、厌氧蝇菌纲、酸杆菌纲丰度均相对较高，占细菌种类的64.14%～70.67%。

变形菌被视为有机质分解转化的主要功能细菌，在纲水平上主要包括α-变形菌纲、δ-变形菌纲和γ-变形菌纲[19]。α-变形菌纲富含大量的固氮细菌，δ-变形菌纲具有促进土壤中氮、磷、硫和有机质循环的作用，γ-变形菌纲是所知的细菌中种类最多的一纲，具有突出的抗菌拮抗作用[20]。本研究结果表明，α、γ和δ-变形菌纲占所有序列的38.18%～46.45%，占主要细菌类群的一半以上。各施肥处理提高了土壤中变形菌纲的相对丰度，其中沼液处理组提高最为显著，这可能和沼液肥所含的有害物质如重金属、有害病原菌有关，致使土壤对沼液肥的不良影响产生代偿性提高作用[21]。从产量提升来看，全化肥处理组提升作用显著，其次是秸秆配施化肥和沼液，这与变形菌纲的相对丰度变化相一致。值得一提的是沼液处理组提升产量与对照组比较效果最低，而秸秆配施沼液处理组提升产量与对照组比较效果显著，这可能与秸秆的添加减缓了沼液中的有害物质对土壤环境的不利影响有关。

本研究中各施肥处理土壤中拟杆菌纲的相对丰度仅次于变形菌纲。本研究发现越是提高梨果产量的处理如全化肥、秸秆配施化肥处理，其拟杆菌纲的相对丰度越低，与产量呈现相反的变化。在其他作物如水稻研究中也同样发现，土壤细菌多样性越高，作物产量越高，拟杆菌门相对丰度越低[13,22]。绿弯菌门厌氧蝇菌纲已被证明可水解纤维素为葡萄糖[23]，本研究中秸秆配施沼液和化肥处理组厌氧蝇菌纲显著增加，这可能与秸秆中含有的纤维素相关。

研究表明向土壤中增施氮肥可降低酸杆菌的相对丰度，这与施氮可降低土壤pH值有关[24]。本研究中，各施肥处理均显著降低土壤中酸杆菌门的相对丰度，尤其是秸秆和沼液的含量越多，土壤酸杆菌相对丰度越低，其中全沼液处理中的土壤酸杆菌相对丰度仅为对照组的1/3，这可能和秸秆与沼液所富含的有机物质有关，也可能和沼液所含的有害物质有关，还需要做进一步的深入研究。另有研究表明，酸杆菌可降解植物残体多聚物，具有光合能力，同时还参与铁循环、单碳化合物代谢[25]，这进一步解释了单施沼液肥降低酸杆菌含量对梨果生长发育不利。

研究表明，保护性微生物放线菌可产生抗生素和酶来提高植物的抗逆性，如耐金属毒性和拮抗病原菌，具有促进植物生长发育、调节土壤理化特性、活化土壤养分而改善土壤健康状况的作用[26]。本研究中，单施化肥和沼液处理组土壤中放线菌纲相对丰度显著降低，秸秆处理组土壤中放线菌纲的相对丰度显著升高，表明了单纯施化肥和沼液降低了梨树的抵抗性，秸秆的添加提升了梨树对外界环境的抗逆能力。

3.3 麦秸秆配施沼液和化肥对土壤细菌群落多样性的影响

土壤微生物在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用，土壤微生物群落多样性及其变化在一定程度上反映了土壤质量，多样性指数越高表明土壤微生物群落的丰富度和多样性越高，土壤健康状况越好[27]。本研究中秸秆添加处理显著升高土壤细菌Chao1指数和Shannon指数。说明秸秆配施沼液和化肥与全化肥或全沼液相比有利于提高土壤细菌群落多样性，提高了土壤生态功能的稳定性。单施沼液或化肥处理中土壤细菌群落多样性指数偏低，这可能与单施沼液或化肥致使某些土壤细菌富集增多，土壤质量降低有关，在本研究中主要优势菌纲的占比在全化肥和沼液处理组显著升高。

综上，秸秆配施沼液或化肥等量代替全化肥不会导致梨果产量降低，但要低于全化肥处理。秸秆的添加与单施化肥或沼液相比降低了优势菌纲的相对丰度，提升了其他菌纲如厌氧蝇菌纲、酸杆菌纲和放线杆菌纲的相对丰度，更有利于提高土壤细菌群落结构丰富度和多样性，提升了土壤生态系统稳定和梨树生长抗逆性。

4 结论

(1)秸秆配施沼液或化肥等量代替全化肥可显著提升梨果产量，但要低于全化肥处理。

(2)秸秆的添加与单施化肥或沼液相比降低了优势菌纲的相对丰度，提升了其他菌纲如厌氧蝇菌纲、酸杆菌纲和放线杆菌纲的相对丰度，更有利于提高土壤细菌群落结构丰富度和多样性，提升了土壤生态系统稳定和梨树生长抗逆性。