基于G1-熵权法和正交设计多指标优化血脉疏通颗粒的提取工艺

陈雪婷，徐文杰，李洁环，冯健英，李智勇，张建军

[广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）/广东省中医药研究开发重点实验室，广东广州510095]

血脉疏通方作为广东省第二中医院的临床经验方，已在临床应用达10年之久，用于改善动脉粥样硬化、斑块形成及冠心病、心绞痛、肢体麻木、活动不利等，效果显著[1]。动脉硬化及斑块形成，多因气虚血瘀，痰浊瘀血阻滞经脉，导致血脉不通，为本虚标实之证。治疗当以补气活血、化痰通脉，标本兼治。血脉疏通方由黄芪、陈皮、党参等十味中药组成，全方共凑补气化痰、消瘀通脉之功。原汤剂内服，存在携带、服用、保存不便的问题，为更好的满足现代人的用药需求，提高病人顺应性，现拟将其制备为颗粒剂。

G1 法是对层次分析法（AHP）进行改进的一种主观赋权法，具有计算速度快、无需一致性检验等优点，而熵权法则是一种客观赋权法，根据各指标的变异程度，利用信息熵计算出各指标的熵权，再通过熵权对各指标的权重进行修正，从而得到较为客观的指标权重[2-4]。本试验以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷以及固形物质量为评价指标，采用G1-熵权法对各评价指标进行权重系数分配，将主观与客观赋权相结合，优选血脉疏通颗粒的最佳提取工艺，以提高试验结果的科学性与严谨性，为后续该制剂的开发与工业化生产提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e2695-2998PDA 高效液相色谱仪、Em‐power®3 工作站（美国Waters 公司），Mettler-Toledo XS205DU电子分析天平［梅特勒托利多（中国）有限公司］，HH-8数显恒温水浴锅（上海力辰邦西仪器科技有限公司），DHG-9035A 型鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 材料

该复方所用中药饮片购于广州众力医药股份有限公司，经广东省中医药工程技术研究院李智勇主任中药师鉴定，均符合《中国药典》2020年版一部各品种项下有关要求。

橙皮苷（批号110721-202019，纯度95.3%）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201505，纯度97.1%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 橙皮苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Waters Xbridge C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～15 min，15%B；15～25 min，15～22%B）；检测波长为260 nm；柱温为30 ℃；流速为1.2 mL/min。

2.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL 含橙皮苷279.8 μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷23.4 μg的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 按处方比例称取饮片195 g，提取2 次，每次加入8 倍量水，提取2 h，滤过，合并滤液，滤液浓缩至250 mL。

精密量取浓缩液5 mL置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流4 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例称取除黄芪、陈皮外的8味饮片，按“2.1.3”项下方法制备阴性对照溶液。

2.1.5 专属性试验 将上述对照品、供试品、阴性对照溶液按“2.2.1”项下色谱条件分别注入高效液相色谱仪，结果见图1。可见，阴性对照溶液色谱图中橙皮苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷相应位置无吸收峰，表明阴性无干扰，专属性良好。

图1 专属性试验HPLC图Figure 1 HPLC chromatogram for specificity test

2.1.6 线性关系考察 精密量取上述混合对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 至1 mL 量瓶中，加甲醇至刻度即制成每1 mL 分别含橙皮苷27.98、55.96、111.92、167.88、223.84 μg，毛蕊异黄酮葡萄糖苷2.34、4.68、9.36、14.04、18.72 μg 的混合对照品溶液，再分别精密量取10 μL 按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（Y）、质量浓度为横坐标（X），得橙皮苷回归方程为Y=3.93×102X-7.32×104，R=0.999 6，毛蕊异黄酮葡萄糖苷回归方程为Y=5.23×103X-4.64×103，R=0.999 7，说明橙皮苷在279.8～2238.4 ng、毛蕊异黄酮葡萄糖苷在23.4～187.2 ng之间线性关系良好。

2.1.7 精密度试验 取同一混合对照品溶液（橙皮苷111.92 μg/mL、毛蕊异黄酮葡萄糖苷9.36 μg/mL），按“2.1.1”项下色谱条件分别进样测定，重复进样6 次，记录峰面积并计算RSD 值，结果显示橙皮苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的RSD 值分别为0.24%、0.35%，表明仪器精密度良好。

2.1.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12 h 按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录峰面积并计算RSD 值。结果橙皮苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积RSD 值分别为0.33%、0.28%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.9 重复性试验 按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液6份，再分别进样测定，记录峰面积并计算RSD值，结果橙皮苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量RSD 值分别为1.45%、1.27%，表明方法重复性良好。

2.1.10 加样回收率试验 取同一批已测定指标成分含量的血脉疏通方浓缩液，精密量取6 份，每份2.5 mL，再精密加入橙皮苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量置具塞锥形瓶中，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液。再按“2.1.1”项下色谱条件进行检测，结果橙皮苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均回收率分别为98.52%、103.27%，RSD 分别为1.62%、1.85%，加样回收率符合要求，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果Table 1 Results of sample recovery test（n=6）

2.2 评价指标综合赋权

2.2.1 G1 法主观赋权[1-5]G1 法是对AHP 法进行改进的一种计算速度快、无需一致性检验的主观评价方法，首先确定评级指标序的关系，记为y1>y2>…>ym；其次，确定相邻指标重要程度之比（rk），rk赋值见表2；确定了rk的理性赋值后，通过以下公式计算权重系数（wk）：

表2 rk赋值参考表Table 2 rk assignment reference table

式中：k=m，m-1……，2。

根据血脉疏通方君臣佐使的配伍原则，及有效成分的药理作用，将3 个指标关系设定为毛蕊异黄酮葡萄糖苷（y1）>橙皮苷（y2）>固形物质量（y3），确定r2=1.3，r3=1.2，即毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度、橙皮苷质量浓度、固形物质量主观权重系数分别为0.414 9、0.319 1、0.266 0。

2.2.2 熵权法客观赋权[5-10]熵是系统无序程度的度量，通过熵值来判断指标的变异程度，变异程度越大，则包含的信息量越多，其对应的权重也应该越高，具体步骤如下：

①建立原始矩阵。设m个评价指标、n个评价对象，形成原始数据矩阵（Xij）mn。Xij表示第i次实验时第j个评价指标的取值。

②将原始矩阵转换为概率矩阵（Pij）mn。

③计算指标熵值（Hi）。

④计算指标权重系数（Wi）。

计算得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、固形物质量客观权重系数分别为0.256 3、0.553 8、0.189 9。

2.2.3 组合权重的确定（Wj） G1 法确定主观权重为W1，熵权法确定的客观权重为W2，计算得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、固形物质量组合权重系数分别为0.318 8、0.529 8、0.151 4。公式如下：

式中：Wj为第j个指标的综合权重；W1j为第j个指标的主观权重；W2j为第j个指标的客观权重；m为评价指标个数。

2.3 血脉疏通颗粒提取工艺优化

2.3.1 正交试验设计 以提取次数（A）、提取时间（B）、加水量（C）为主要考察因素，以橙皮苷质量浓度和毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度及固形物质量为评价指标，采用L9（34）正交设计优选血脉疏通颗粒的水提工艺，试验设计见表3。

表3 因素与水平Table 3 Factors and levels

2.3.2 固形物质量的测定 精密吸取各样品浓缩液25 mL，置已恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干，照2020年版《中国药典》四部“干燥失重测定法”测定，计算固形物质量，公式如下：

固形物质量=（W×V）/25，

式中：W为25 mL 浓缩液中干固形物质量，V为定容体积。

2.3.3 正交试验结果分析 按处方比例称取饮片9份，每份195 g，按正交试验因素水平设计表对血脉疏通颗粒提取工艺进行优化，提取液按“2.1.1”项下色谱条件进样计算橙皮苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量及固形物质量，结合“2.2.3”项下的组合权重，进行综合评分，结果见表4、表5。由方差分析结果可知，影响提取效果的因素顺序为提取次数>加水量>提取时间，其中提取次数对试验结果有显著影响（P<0.05），确定最优提取工艺为：A3B1C1，即提取3次，每次加6倍量水，提取1 h。

表4 正交试验设计及结果Table 4 Orthogonal experimental design and results

表5 方差分析结果Table 5 Analysis of variance results

2.4 验证试验

称取饮片3份，按上述优选工艺提取，再分别测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷含量及固形物质量，结果显示，3 批平行试验综合评分平均值为99.25，RSD 为0.93%，表明优选的工艺稳定性良好。结果见表6。

表6 验证试验结果Table 6 Validation test results

3 讨论

血脉疏通颗粒对气虚痰瘀型颈动脉硬化及斑块形成患者的临床疗效显著，受到广泛认可，全方由黄芪、陈皮、党参等10 味饮片组成。文献研究显示，本处方药材同功能主治及现代药理作用相关的主要有效成分主要存在于水提取液中，包括皂苷类化合物、黄酮类化合物、氨基酸等[11-12]，结合本处方在临床运用中一直以汤剂入药有效的现状以及生产设备条件，确定提取工艺是全方采用水煎煮提取。

中药复方制剂起效成分复杂多样，采用多指标优化显然更符合现代制剂的需求，考虑到毛蕊异黄酮葡萄糖苷是君药黄芪的主要有效成分，可以通过调节NO/cav-1/MMPs 通路，保护脑缺血再灌注大鼠血脑屏障的完整性[13-14]；橙皮苷作为臣药陈皮的主要有效成分，能够促进巨噬细胞极化，从而抑制高脂饮食诱导的ApoE-1-小鼠动脉粥样硬化的发展[15]；固形物质量则直接影响到制剂的成型性能，也是药效的物质基础。因此，本试验选取毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度、橙皮苷质量浓度、固形物质量作为评价指标，使优选的提取工艺更符合中药复方制剂多成分、多靶点的治疗体系。

在多指标综合评价中，权重的确定极为重要，本试验采用G1-熵权法主客观组合赋权，同时兼顾了试验者的主观性与待评价对象的客观内在联系，使得血脉疏通颗粒提取工艺多指标评价结果更加科学严谨。