干酪乳杆菌产β-甘露聚糖酶发酵条件优化及在果汁澄清中的应用

王 烁，季海蕊，曹慧莹，赵 丹，3*

（1.黑龙江大学 农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150500；2.黑龙江大学 生命科学学院微生物省高校重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150080；3.广西民族大学 海洋与生物技术学院 广西多糖材料与改性重点实验室，广西 南宁 530008）

β-1,4-D-甘露聚糖酶（以下简称甘露聚糖酶），是一种胞外水解酶，能水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中的1,4-D-甘露糖苷键[1]。甘露聚糖酶广泛存在动物、植物和微生物中，其中微生物甘露聚糖酶因来源丰富，活性高、成本低、易提取等特点[2]，广泛应用于采油、钻井、造纸以及食品领域的果汁澄清、动物饲料、酿造和益生元制备等行业[3-5]。产酶微生物包括芽孢杆菌属（Bacillus）[6]、青霉菌属（Penicillium）[7]和链霉菌属（Streptomyces）[8]等，但受生物安全性的限制，常用产酶菌株已无法满足食品领域对高安全性酶日益增长的需求。

目前报道能产酶的乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）种属有乳杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）和魏斯氏菌属（Weissella）[1，9-13]，因LAB作为公认安全性（generally regarded as safe，GRAS）菌株[9]的特性，为甘露聚糖酶在医药、食品、饲料等行业的应用提供了安全来源[14-16]。但受产酶水平低的限制，挖掘新的产酶乳酸菌并优化提高产酶能力，是高生物安全性食品级甘露聚糖酶研究的热点。

本研究鉴定了课题组先前分离的产甘露聚糖酶的菌株3MP-5-3，结合Placket Burman（PB）设计和中心组合设计（central composite design，CCD）优化供试菌株产甘露聚糖酶的发酵培养基，并探索供试菌株甘露聚糖粗酶液在果汁澄清的应用潜力。本研究旨在丰富乳酸菌甘露聚糖酶菌株的来源，为甘露聚糖酶在安全性要求更高的食品领域进一步应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌株3MP-5-3：分离自东北酸菜发酵液，保藏于黑龙江大学微生物重点实验室。

魔芋粉：四川新星魔芋粉厂；角豆胶（CAS：9000-40-2）：美国Sigma Alrich公司；细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒（DP302-02）、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（DP209-02）：TIANGAN股份有限公司；API50CHL鉴定试剂条（OT-50410）：法国生物梅里埃公司。

MRS培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母浸粉5 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，柠檬酸铵2 g/L，无水亚硫酸钠0.1 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸锰0.05 g/L，无水乙酸钠5 g/L，吐温80 1 mL；pH 5.5；121 ℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

SP-1920UV型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；MLS-3780型蒸汽压力灭菌锅：日本三洋电子有限公司；BX43生物显微镜：奥林巴斯（深圳）工业有限公司；XTS20型连续变倍体视显微镜：北京福凯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 种子液制备

取-80 ℃冰箱内保藏菌种，以2%（V/V）接种量接种于100 mL/250 mL MRS液体培养基中，37 ℃、160 r/min培养至细胞浓度为1×108个/mL的种子液。

1.3.2 菌株鉴定

利用体视镜和显微镜观察菌株的菌落形态和显微形态[17]。

利用API 50 CHL鉴定试剂条对菌株进行糖发酵试验的鉴定[18]。

按照姜静等[19]的方法，利用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取产甘露聚糖酶乳酸菌基因组DNA。选择16S rDNA通用引物上游（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和下游（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。PCR条件为95 ℃变性3 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物完成琼脂糖凝胶电泳1.0%后使用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段并测序。根据美国国家生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）数据库对序列同源性进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析。利用MEGA 5.0软件根据序列同源性选择不同的菌株构建系统发育树。

1.3.3 酶活测定

取种子液，以2%（V/V）接种量接种于100 mL/250 mL MRS液体培养基中，37 ℃、160 r/min培养，获得发酵液后，8 000 r/min离心15 min，获得粗酶液。以溶解在50 mmol/L醋酸-乙酸钠缓冲液中，pH 4.0的5 g/L角豆胶为底物，3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法测定甘露聚糖酶酶活[20]。酶活性单位定义：每分钟产生1 μmol甘露糖所需的酶量（U/mL）。

1.3.4 PB试验设计

以PB试验设计模型，优化甘露聚糖酶的酶活。根据单因素试验结果[21]，筛选出对甘露聚糖酶酶活有显著影响的7个因素，分别是角豆胶、葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏、柠檬酸铵、初始pH值，按照表1所示设计每个变量的水平。

表1 PB试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of PB tests design

1.3.5 中心组合设计

采用KAMMOUN R等[22]所述的包含每个变量的个体效应和交叉效应的二阶多项式回归方程拟合试验数据，确定最优自变量的预测。以PB设计确定影响β-甘露聚糖酶酶活（Y）的3个最显著因子（角豆胶、酵母提取物、初始pH值）为自变量采用响应面试验的CCD设计进行优化。如表2所示3个自变量在5个不同的水平（-1.68，-1，0，+1，+1.68），进行研究。利用CCD预测的最佳条件重复6次发酵试验，比较试验值与模型预测值，验证模型的有效性。

表2 中心组合试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels of central composite tests design

1.3.6 果汁的出汁率及澄清度

选取苹果、橙子、桃子、柿子和蓝靛果洗净、晾干、制成匀浆用于制备果汁。按照NADAROGLU H[12]的方法检测粗酶液对果汁出汁率的影响。10 g水果样品匀浆中加入2 mL酶溶液，在60 ℃、pH 7.0条件下反应1 h，四层纱布过滤15 min，测定获得的果汁体积，计算最终出汁率。以蒸馏水为对照，紫外-可见分光光度计在660 nm波长处测定OD660nm值，以透光率百分比（%）来表示澄清度。

1.3.7 数据处理

试验处理设置3个重复，数据均用“平均值±标准差”表示。采用JMP 9.0.2软件进行方差分析和试验数据的多重比较。统计学检验的显著性水平设置为P＜0.01和P＜0.05，分别表示差异极显著和显著。采用Design Expert 8.0.5进行响应面试验设计和回归分析。

2 结果与分析

2.1 产甘露聚糖酶的菌株鉴定

菌株的菌落形态结果（图1）表明，菌株3MP-5-3菌落为圆形，乳白色。菌体呈杆状，大小（0.4～0.6）μm×（1.8～2.0）μm。

图1 菌株3MP-5-3的菌落形态（10×）（a）和扫描电镜形态（b）Fig.1 Colony morphology (10×) (a) and scanning electron microscope morphology (b) of strain 3MP-5-3

糖发酵试验结果（表3）表明，菌株3MP-5-3可以利用D-核糖、D-葡萄糖、D-果糖及D-甘露糖等，而不能利用甘露醇、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖及D-乳糖等，发酵特征与干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）最为相似，为97.8%。

表3 菌株3MP-5-3的糖发酵试验结果Table 3 Results of carbohydrate fermentation of strain 3MP-5-3

菌株3MP-5-3基于16S rDNA构建的系统发育树结果见图2。部分序列长度1 457 bp，GenBank登录号：MT658743。Blast比对结果显示，该菌株与L.casei050（JN560851）16SrDNA部分序列相似性最高，达到99.72%。结合形态学、生理生化特征和16S rDNA基因序列比对，菌株3MP-5-3鉴定为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）。

图2 基于16S rDNA基因序列菌株3MP-5-3的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strain 3MP-5-3 based on 16S rDNA gene sequences

2.2 PB设计结果

PB试验设计及结果见表4，回归分析结果见表5。由表5可知，模型P值为0.032 1＜0.05，表明模型对结果影响显著，观测值和预测值之间存在可接受的相关性。7个因素中角豆胶、酵母提取物和初始pH值3个因素P值分别为0.023 0、0.031 1和0.006 2均＜0.05，表示对酶活有显著影响。角豆胶、酵母提取物和初始pH值3个因素的回归分析系数为正，对酶活为正效应。且决定系数R2=0.932 3，调整决定系数R2=0.813 9，精密度9.560 8，表明所得模型能够较好的拟合试验数据。根据PB试验设计结果将角豆胶、酵母提取物、初始pH值三个影响因素用于后续试验。

表4 PB试验设计及结果Table 4 Design and results of PB tests

表5 PB试验回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of PB test regression model

2.3 中心组合试验设计结果

CCD设计及结果见表6，方差分析结果见表7。由回归分析（表7）可知，模型的P值为0.000 2＜0.01极显著，其中X7、X12、X32、X72对酶活影响达到极显著水平（P＜0.01），R2为0.937 2接近1，说明预测值和实测值之间具有高度的相关性。以上结果表明模型拟合程度高，可信度高。

表6 中心组合设计试验设计及结果Table 6 Design and results of central combination design tests

表7 中心组合设计试验回归模型方差分析Table 7 Variance analysis of central combination design test regression model

所得数据进行多项式回归分析，变量为编码水平时，拟合得二次方程为：

式中二次项系数均为负，可知该方程拟合的曲面开口朝下，方程有极大值。因此当各因素X1、X3和X7编码水平分别为-0.102、-0.595和0.566时，即角豆胶、酵母提取物和初始pH值分别为5.69 g/L、5.22 g/L和6.10时，方程有极大值，酶活为75.59 U/mL。

2.4 响应面交互作用分析

角豆胶、酵母提取物、初始pH值3个影响因素之间的交互作用对酶活的影响的响应面及等高线见图3。其中在角豆胶（4～8）g/L、酵母提取物（4～10）g/L和初始pH值6左右的条件下，甘露聚糖酶活性不断增加。当角豆胶、酵母提取物和初始pH值分别为5.69 g/L、5.22 g/L和6.10时，最大酶活预测值为75.59 g/L。根据模型优化结果和实际条件结合，设置初始pH值6.1，角豆胶5.70 g/L和酵母提取物5.20 g/L。在此条件下做验证试验，重复6次，甘露聚糖酶酶活的平均实际值为（75.83±0.31）U/mL，与预测值较吻合，结果与优化前相比提高了1.17倍。

图3 各因素间交互作用对干酪乳杆菌3MP-5-3甘露聚糖酶酶活影响的响应面与等高线图Fig.3 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on mannanase activity of Lactobacillus casei 3MP-5-3

2.5 L.casei 3MP-5-3甘露聚糖酶对果汁澄清的影响

因为果汁具有较高的黏度和浑浊度，生产果汁是一个非常复杂的过程且需要很高的成本[23]。利用酶制剂处理果汁原料以提高果汁澄清度已得到业界的认可并得到广泛应用。甘露聚糖酶水解果汁中的甘露聚糖降低黏度的同时提高产量[24]。将L.casei3MP-5-3产的甘露聚糖酶应用于苹果、橙子、桃子、柿子和蓝靛果的果汁生产，试验结果见表8。

表8 干酪乳杆菌3MP-5-3甘露聚糖酶对果汁澄清的影响Table 8 Effect of mannanase produced by Lactobacillus casei 3MP-5-3 on fruit juice clarification

由表8可知，甘露聚糖酶对果汁澄清效果和出汁率均有促进作用，其中与离心组相比，柿子汁澄清效果最好，提高了20.8%，其次是苹果汁，提高了14.3%。而五种水果出汁率中，苹果出汁效果最好，提高35.6%，橙子次之。此外，L.casei3MP-5-3甘露聚糖酶对苹果、橙子和桃子果汁出汁率的提高明显优于绿色魏斯氏菌（Weissella viridescens）LB37[11]。并且L.casei3MP-5-3甘露聚糖酶对于柿子、苹果和桃子果汁的澄清度酶处理组比对照组分别提高了19.9%、20.5%和18.9%，而陈伟等[25]发现甘露聚糖酶使得柿子、苹果和桃子果汁澄清度分别提高了31.8%、7.0%和4.0%。因此除柿子汁外，L.casei3MP-5-3甘露聚糖酶苹果和桃子果汁澄清度的提高程度要大于通过嗜热甘露聚糖酶毕赤酵母工程菌表达的甘露聚糖酶。重要的是，利用LAB具有生物安全性的优势，本研究无需对L.casei3MP-5-3进行异源表达，获得粗酶操作更简单，成本更低。

3 结论

本研究鉴定出一株产甘露聚糖酶的菌株3MP-5-3为L.casei。通过响应面法优化菌株的发酵条件为角豆胶5.69 g/L、酵母提取物5.22 g/L、葡萄糖8.00 g/L、蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、柠檬酸铵3.0 g/L、1 mL吐温80和初始pH值6.1。在此优化条件下，甘露聚糖酶酶活为（75.83±0.31）U/mL，是优化前的1.17倍。此外，粗酶液对苹果、橙子、桃子、柿子和蓝靛果5种水果的果汁出汁率和澄清度的提高均高于离心组，与其他5种乳酸菌结果相似，且对苹果桃子的出汁率影响为最优。该结果表明L.casei3MP-5-3粗甘露聚糖酶在果汁澄清具有经济、简便的应用潜力，也为乳酸菌甘露聚糖酶在其他食品级领域的应用提供了一定的理论指导。