表观遗传修饰在过敏性鼻炎中的作用

李静，周义兵，陈若希，邱昌余，程雷

表观遗传学(epigenetics)的概念于1939年首先由Waddington提出，从一定程度上解释了基因型向表型转变过程中的分子及生物学机制，即保持DNA测序不变而表型发生可遗传的改变，包括DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA等[1]。表观遗传修饰可调节细胞转录及基因组稳定性，从而使基因表达和转录调控改变，扰乱生物通路并在人类疾病中发挥至关重要的作用。因此，表观遗传学在众多领域被广泛研究，例如恶性肿瘤、自身免疫性疾病、呼吸系统疾病、内分泌疾病、心血管疾病、胃肠道疾病、神经系统疾病等[2- 4]。

众所周知，过敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是由基因和环境共同作用所引起的鼻黏膜慢性炎症性疾病。研究显示，AR的遗传度为33%～91%[5]。全基因组研究证实，AR发病机制中有多个易感位点及候选基因，但每个基因中风险相关的等位基因却只占总体遗传风险的一小部分[5- 6]。AR及哮喘均为气道过敏性疾病，且部分患者常常是两种疾病并存的状态。在表观遗传学研究方面，针对哮喘或AR伴哮喘的研究较单纯AR更早、更广泛[7]。大量研究表明表观遗传修饰可影响免疫通路富集的Th1、Th2、调节性T细胞和其他免疫细胞转录因子的表达，可使多种细胞因子表达异常，并在上皮细胞中表现出来[8- 9]。鉴于“同一气道同一疾病”的理念，有学者认为AR和哮喘可能有共同的免疫遗传学机制，致敏基因位点可引起系统性的变态反应[10]。本文对近年来AR的表观遗传学研究进展作一综述。

1 DNA甲基化与AR

DNA甲基化是最早发现且研究最为广泛的表观遗传修饰，其通常发生在CG二核苷酸中的胞嘧啶(CpGs)5位碳原子上[3]。研究发现，有些基因的甲基化水平与哮喘或AR发病呈正相关(如AXL基因的CpGs)[11]，而有些则呈负相关(如GATA- 3基因的CpGs、IL-13基因的CpG38)[12-13]。一项对455名新生儿长达16年的前瞻性队列研究发现，在单一CpG水平上虽然未发现与哮喘显著相关的DNA甲基化，但确定了16个与哮喘显著相关的差异甲基化区域(differentially methylated regions，DMRs)，并且DMRs与AR伴或不伴哮喘均显著相关[14]。Jahreis 等[15]在哮喘模型中发现了13个与启动子或增强子高甲基化相关的转录下调基因，认为GATA- 3阻滞剂锌指蛋白1可能是Th2驱动的哮喘易感性增加的潜在介质。Zhang 等[16]发现了35个与过敏相关的CpGs，其中cg10159529的DNA甲基化与外周血IL- 5受体的表达强度相关。Legaki等[17]认为ACOT7、EPX、KCNH2、SIGLEC8、TNIK、FOXP1、ATPAF2、ZNF862、ADORA3、ARID3A、IL5RA、METRNL及 ZFPM1这13个基因是外周血及鼻黏膜上皮细胞中较为常见的DMRs，其在AR中的作用还有待进一步探索。动物实验发现，屋尘螨变应原组分Derp1致敏的AR母鼠发生 FOXP3的DNA甲基化改变，可使其子代小鼠发生免疫异常[18]。不仅如此，小鼠跨代哮喘模型研究还发现，这种DNA甲基化改变可以遗传超过2代[15]。人群研究同样如此，相比于母亲没有哮喘病史，那些母亲有哮喘病史的儿童外周血和脐带血均有明显的DNA甲基化改变[19]。妊娠期间母体尿液中一种邻苯二甲酸丁苄酯(butyl benzyl phthalate，BBP)的代谢产物——邻苯二甲酸单丁酯(mono-n-butyl phthalate，MBP)浓度较高与6岁以下子代儿童哮喘风险增加有相关性[15]。甚至，妊娠期暴露于BBP的母亲母乳喂养也可使子代嗜酸粒细胞性气道炎症的风险增加[15]。众多研究表明，表观遗传改变是可遗传的，甚至可能代代相传，使后代患过敏性疾病的风险增高[9]。

环境与表观遗传学密切相关，基因和环境的交互作用导致的表观遗传改变可促进AR和哮喘的发生[4，20]。当环境发生变化时，表观遗传基因组可发生快速的DNA甲基化改变。研究发现，在草花粉暴露3h后外周血单核细胞便可发生表观遗传改变[21]。与健康对照组相比，AR患者组有42个基因位点发生了显著的甲基化水平增高。通过焦磷酸测序发现，草花粉暴露后TPSG1(tryptase gamma 1)、SLFN12(schlafen 12)及MUC4(mucin 4)基因的DNA可发生不同的甲基化变化；进一步分析发现，SLFN12的DNA甲基化基线水平可预测患者花粉暴露后过敏症状的严重程度，而MUC4的DNA甲基化变化值与鼻呼气气流的降低程度有相关性[21]。接触高浓度的CO、NO2及PM2.5可使哮喘患者FOXP3基因的DMRs水平增高[22]。类似的变化也出现在AR患者中，研究发现生命早期的环境因素可显著影响免疫系统及组织细胞的表观遗传改变，尤其是PM2.5可促进CD4+细胞IFN-λ基因启动子的DNA甲基化，从而促进儿童AR的发生[23- 26]。Morin 等[26]研究显示，婴儿时期的上呼吸道微生物组成参与了儿童时期AR的发展，且在一定程度上是通过改变上呼吸道黏膜上皮细胞的DNA甲基化来介导的。研究认为吸烟、空气污染物、霉菌及潮湿环境可以增加过敏性疾病的患病风险[9，14，27]。Qi等[14]从表观遗传学角度分析了4个环境因素(主动吸烟、被动吸烟、宠物接触、房屋中潮湿和霉菌环境)与过敏性疾病之间的关系，结果显示在60个CpGs中cg03565274与宠物接触的相关性最密切，且其甲基化水平与AR及哮喘发病呈负相关，无论是出生后就接触宠物还是幼儿期或中学时期开始接触宠物的儿童，cg03565274的DNA甲基化水平均较高。这一结果也从表观遗传学角度提示长期接触宠物的儿童不易罹患过敏性疾病，但其他3个环境因素与所观察的60个CpGs甲基化水平并无明显相关性。

与AR及哮喘相关的DNA甲基化信号主要由特异性IgE驱动，因此鼻黏膜上皮细胞DNA甲基化可作为IgE致敏的标志物[14]。在下鼻甲鼻刷样本中发现了可复制的AR和哮喘的DNA甲基化谱，其可作为气道过敏性疾病潜在的生物标志物，并可用于预测儿童AR或哮喘的发生[14，28]。

世界上首批DNA甲基化拮抗剂是2004年由美国FDA批准的氮杂胞苷及地西他滨，用于治疗白血病[29]。动物实验显示，患有哮喘的雌性大鼠在交配前使用DNA甲基化拮抗剂，可避免其将哮喘的遗传表型传递给下一代，而吸入糖皮质激素及β受体激动剂则无法避免[30- 31]。研究还发现，使用DNA甲基化拮抗剂对母亲暴露于BBP所导致的过敏性哮喘表型高风险的子代小鼠进行治疗，其肺泡灌洗液中卵清蛋白、卵清蛋白特异性气道阻力、嗜酸粒细胞、IgE以及IL- 4、IL- 5和IL-13等细胞因子水平均降低，表明DNA甲基化拮抗剂可逆转母体BBP相关的气道炎症[15]。随着研究的深入，DNA甲基化拮抗剂未来有可能成为治疗AR及哮喘等过敏性疾病的新方式。

2 组蛋白修饰与AR

相比于DNA甲基化，目前对组蛋白修饰的研究相对较少。组蛋白修饰包括组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，其在DNA损伤修复、核染色质结构及活性的调节等方面发挥一定作用[3，32- 33]。

组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases，HATs)及组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)调节。Alaskhar等[33]对组蛋白修饰在过敏性疾病中的作用进行综述，认为组蛋白修饰在促进T细胞和巨噬细胞参与气道重塑过程中具有一定的调节作用，还与过敏症状有直接联系。研究发现，AR患者及AR小鼠的免疫细胞中HDACs水平均明显增高，HDACs水平升高可抑制钾离子通道1的功能，使鼻黏膜上皮细胞功能紊乱从而产生鼻部症状[34]。Steelant等[35]的研究与之基本吻合，认为HDACs活性与鼻黏膜上皮细胞完整性呈负相关，可将其作为上皮屏障功能的评价指标。AR小鼠使用HDACs抑制剂治疗后，鼻部症状缓解[34]。动物研究还发现，HDACs抑制剂可使FOXP3、IL-10及IFN-λ的表达量增高，IL- 4及IgE水平降低，这些结果从Ⅰ型变态反应的炎症通路角度解释了其治疗机制[36- 37]。目前对HDACs抑制剂的临床试验正在肿瘤领域开展，其安全性和有效性有待进一步评价[38]。

在哮喘方面的研究发现，组蛋白甲基化与CD4+的T细胞分化相关，组蛋白H3赖氨酸4三甲基化与IFN-γ和IL- 4的转录增加有关[4]。而组蛋白甲基化、磷酸化和泛素化等修饰在AR中的作用仍有待进一步研究。

3 非编码RNA与AR

非编码RNA包括微小RNA(microRNA，miRNA)、环状RNA(circRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)等，其虽不能编码蛋白质，但可在生物进程中发挥重要调节作用。

miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA，在转录后通过阻断mRNA翻译或改变mRNA稳定性来调控基因表达，与AR密切相关[39- 40]。研究发现，miRNAlet- 7f、miRNA- 9、miRNA-17-18-19- 20- 92、miRNA- 26a/b、miRNA- 27a/b、miRNA-125b、miRNA-155可使巨噬细胞向促炎M1表型极化，而miRNAlet- 7a/b/c/d/e、miRNA- 21、miRNA- 34、miRNA-124、miRNA-146a/b、miRNA- 223- 3p、miRNA- 511- 3p则促进向抗炎M2表型极化[41]。miRNA在AR和哮喘中的作用，有上调和下调之分。已知上调的包括miR- 498、miR-187、miR- 874、miR-143、miR- 886- 3p、miR-133b、miR- 375、miR- 487b、miR-16等，下调的包括miR-18a、miR-126、let- 7e、miR-155、miR- 224、miR-149等[42- 43]。随后有研究发现hsa-miR- 93- 5p、hsa-miR- 92a- 3p、hsa-miR- 21- 5p可调控SLC14A1、SNCA、TNS1、KAT2B基因，并可能在AR合并哮喘综合征中发挥着重要作用[44]。文献报道，AR患者鼻黏膜组织及外周血中均发现有miRNA的改变，其通过影响鼻黏膜2型固有淋巴样细胞、外周血调节性T细胞和B细胞而进一步调控炎性细胞因子的表达[39]。此外，近年陆续的研究表明miR-135a、miR-146a、miR-149、miR-181a、miR- 323- 3p、miR- 92b、miR- 210、miR- 34a及miR-199- 3p等均可能在AR等过敏性气道炎症中发挥着一定的调节作用[45- 49]。主要表现在miRNA可干扰炎症通路，使Th1/Th2细胞比例失调，IL- 4、IL-13等炎症因子及IgE异常表达，干扰肥大细胞激活及脱颗粒[43，45，49]。

circRNA是一种闭环结构的RNA。高通量基因测序研究发现，circRNA的miRNA分子海绵效应在AR发病中也具有重要作用，表现在AR患者鼻黏膜上皮细胞中hsa-circ- 0008668、circTRIQK表达上调，hsa-circ- 0029853、circRNA- 01002表达下调[50]。circDdx17使miR-17表达量降低，从而可缓解卵清蛋白诱导的AR小鼠症状和病理损害，提示circDdx17对AR的发生发展具有保护作用，未来有望成为新的治疗方向[51]。患者鼻黏膜上皮细胞体外实验发现，敲除circARRDC3基因可使IL-13诱导的鼻黏膜上皮细胞中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)和嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)和黏蛋白5AC的水平降低，使细胞稳定性增加并抑制凋亡。miR- 375的表达水平与circARRDC3及KLF4(krueppellike factor 4)负相关，而circARRDC3和KLF4的表达呈正相关，即circARRDC3可通过调节miR375/KLF4 轴促进AR的发生发展[52]。

lncRNA是一种竞争性内源性RNA，也可通过miRNA海绵效应调节目标mRNA的3’端未翻译区，但其在过敏性疾病方面的研究尚少见。有报道认为lncRNA在IL-13分泌的正向调控、FcεRI和NF-κB信号通路中发挥一定的作用，还可促进树突状细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞的分化与激活[39]。新近的研究显示，circHIPK3和lncGAS5通过调节共同靶标miR- 495而促进Th2分化，从而加重AR小鼠的症状。鼻内给予circHIPK3/lncGAS5敲除的慢病毒可通过下调GATA- 3而减轻AR症状[53]。综上可知，通过分子海绵效应circRNA及lncRNA 可改变miRNA结合mRNA 的能力，即通过circRNA/lncRNA-miRNA-mRNA调控网络影响疾病的走向[51- 53]。

综上，本文从DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA三个方面总结了表观遗传修饰在AR中的作用。然而，AR为多基因遗传病，且炎症通路中涉及的细胞因子/趋化因子众多，因此表观遗传修饰作用靶点也较多，作用通路及调控机制仍不明确。目前的研究在取材、研究技术、研究设计、统计方法及年龄分层等方面还有待完善[17]。表现在：(1)既往表观遗传学研究多取材于外周血和鼻黏膜上皮细胞，且血液中单核细胞和嗜酸性粒细胞是目前研究中常用的免疫细胞，然而表观遗传的改变有细胞和组织特异性，因此血液中其它类型免疫细胞(如淋巴细胞、中性粒细胞)和其他呼吸道细胞(如杯状细胞)的表观遗传修饰尚需研究补充[4，17]。表观遗传可影响多种疾病、多个器官，因此传统的高通量测序技术所得的表观遗传标志物的敏感性和特异性较低，目前单细胞测序技术的发展则提供了更佳的技术条件。(2)有学者认为DNA甲基化水平存在种族、社会经济状态、环境、年龄及性别等方面的差异[9，54- 55]。如何排除混杂因素仍需更严密的研究设计。此外，目前的研究多为横断面研究，受时间限制纵向研究尚不多。(3)研究发现利用牧草花粉和尘螨制剂进行舌下免疫治疗可以使患者FOXP3基因的CpG位点DNA甲基化水平降低[3]，但免疫治疗能否避免将AR和/或哮喘的遗传表型传递给下一代仍需深入研究。细胞因子拮抗剂(如奥马珠单抗)在哮喘及AR领域初显成效，其能否降低患者表观遗传水平、能否避免将遗传表型传递给子女也有待进一步验证。

综上所述，目前的研究成果显示，表观遗传改变有望用于AR的早期检测、治疗和预防，在预测和评估治疗的疗效方面也有潜在价值[39- 40，56]。