山苍子植株再生体系的优化*

王 阳 张付豪 窦 敏 许 婷 陈 昊

(中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室 中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业和草原局重点实验室 长沙 410004)

山苍子(Litseacubeba)为樟科木姜子属的落叶灌木或小乔木，广布于我国长江以南各省区，其中湖南省是我国山苍子种质资源的主要分布区之一，在低山和丘陵区均有分布(谷战英等， 2017)。山苍子作为中国特色芳香油植物资源之一，其叶、花和果皮均含有芳香油，是重要的芳香植物(刘晓棠等， 2008)。从山苍子果实和叶子中所提取的山苍子油中醛类成分约占总成分的70%(Lietal.， 2014)，其中柠檬醛含量高达60%～90%(吴厚玖等， 1997)。柠檬醛是生产抗氧化剂、杀虫剂、抗微生物药物的重要原料，在香料工业和医疗工业上有重要用途(Luoetal.， 2004； Ameretal.， 2006； 喻阿坤等， 2019)。

受柠檬醛等代谢产物的影响，山苍子枝条伤口处易被氧化，使得山苍子扦插和嫁接较为困难，目前，山苍子主要以野生植株的种子进行实生繁殖，但其种子发芽率较低，常导致育苗失败。此外，山苍子属于雌雄异株植物，实生苗木会发生性状分离，导致其优良性状在杂种后代中难以保存(吴松成等， 2003； 王玉昆等， 2005)。植物组织培养技术因具有繁殖系数高、繁殖速度快和易保持母体优良性状等优点，目前已成为工厂化育苗的重要途径(Robertonetal.， 1988； Thomas， 2008； Kimetal.， 2017)。此外，建立愈伤组织诱导与不定芽分化体系可为植物遗传转化研究提供技术支撑。因此，建立高效的山苍子愈伤组织诱导及植株再生体系，不仅可以进行山苍子良种的工厂化繁育，还可以为山苍子遗传转化体系的建立奠定基础。

目前，关于山苍子组织培养研究的报道相对较少。Mao等(2000)研究发现，6-BA是山苍子茎尖诱导不定芽的适宜细胞分裂素。尹红(2000)以山苍子茎段为外植体，筛选出愈伤组织形成的适宜激素质量浓度组合和pH值。通过对不同外植体的脱分化效果进行比较发现，茎段外植体尽管愈伤组织诱导效率高于叶片外植体，但其诱导效率和状态仍不能满足后续增殖和分化的要求(马崇坚等， 2005； 雷明等， 2008)。通过后续研究的改进，山苍子茎段愈伤组织的诱导率可达100%，但不定芽分化率低，最高仅为28.57%，且分化出的不定芽生根率仅为45.33%，也未进行后续再生植株的移栽试验(林丽媛等， 2013)。已有研究结果表明，山苍子组织培养过程中存在愈伤组织诱导效率不稳定，再分化与生根效率低，未进行再生植株移栽试验等问题，尚不能应用于种苗工厂化繁育。鉴于此，本研究以山苍子茎段为外植体，进行山苍子组培条件的优化和再生植株的移栽试验，通过对愈伤组织诱导和增殖条件的比较，获得具有分化能力的愈伤组织，并对不定芽分化和生根条件进行了优化，显著提高了山苍子不定芽分化率与生根率，再生植株移栽成活率高，可以满足山苍子良种的工厂化繁育需求，为后续山苍子遗传转化体系的建立提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取种植于中南林业科技大学山苍子实验基地的健康、无病虫害的山苍子优良雌株，取其春稍半木质化茎段的节间(不带芽)作为诱导愈伤组织的外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的表面灭菌 将外植体置于玻璃瓶中，先用洗衣粉浸泡15min，再于流水下冲洗1 h后，转至超净工作台上进行外植体的表面灭菌处理。75%的乙醇处理外植体25 s，用0.1%的HgCl2处理8min，无菌水冲洗4～5次，最后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分(张付豪等， 2019)。在培养皿中将茎段切为0.5cm长的小段，将其横放于培养基上。

1.2.2 山苍子愈伤组织的诱导 以1/2 MS培养基为基本培养基，附加的植物生长调节剂为6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)、萘乙酸(naphthylacetic acid，NAA)，按照正交试验设计L9(33)，设9个处理，每个处理接种10瓶，每瓶接种3个外植体，重复3次。28天后观察并统计愈伤组织诱导率、褐化率及生长状况。

1.2.3 愈伤组织的继代增殖 将愈伤组织从茎段上切下并去除褐化部分后，接种到含不同质量浓度6-BA、NAA的1/2 MS培养基上。按照正交试验设计L9(32)，设9个处理，每个处理接种10瓶，每瓶接种3～5块愈伤组织，重复3次。28天后观察并统计愈伤组织增殖系数、质地及生长状况。

1.2.4 不定芽分化 将致密的愈伤组织接种到含不同质量浓度6-BA和吲哚丁酸(indole-3-butyric acid，IBA)的1/2 MS培养基上。按照正交试验设计L9(32)，设9个处理，每个处理接种15瓶，每瓶接种2块愈伤组织，重复3次。28天后观察并统计不定芽分化率及平均不定芽数。

1.2.5 生根培养 将生长至3～5cm的不定芽转至含不同质量浓度IBA和活性炭的1/2 MS培养基上。按照正交试验设计L9(32)，设9个处理，每个处理接种10瓶，每瓶接种1个不定芽，重复3次。28天后记录生根情况，统计不定芽生根率及平均根数。

1.2.6 炼苗与移栽 将生长健壮和根系粗壮的再生植株先拧松组培瓶瓶盖炼苗1天，随后以瓶盖半开状态炼苗1天，最后从组培瓶中取出，洗净根系上附着的培养基后，置于盛有水的玻璃瓶中完全打开瓶盖炼苗2天。炼苗完成后将其移栽于营养土、营养土∶珍珠岩= 3∶1(V/V)、红壤土∶营养土∶珍珠岩= 2∶1∶1(V/V)、红壤土∶营养土∶珍珠岩= 1∶1∶1(V/V)的移栽基质中，移栽后放置于湿度为60%～70%的人工气候室，覆盖一层保鲜膜保湿培养2天后揭取。移栽28天后统计移栽成活率。

1.3 培养条件

本研究培养基中均添加30 g·L-1蔗糖(除生根培养基中添加20 g·L-1蔗糖外)、7 g·L-1琼脂，pH值调至5.8，于121℃高压灭菌20min后使用。组培材料放置于培养温度为(25±2)℃，光照强度为20μmol·m-2s-1，光照时间为14 h·d-1的培养室内培养。

1.4 数据统计

愈伤组织诱导率=形成愈伤组织的外植体数/接种成活的外植体数× 100%； 愈伤组织褐化率=愈伤组织褐化数/接种的愈伤组织数× 100%； 愈伤组织增殖系数=增殖后的愈伤组织质量/增殖前的愈伤组织质量； 不定芽分化率=分化出不定芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织数× 100%； 不定芽生根率=生根的不定芽数/接种的不定芽数× 100%； 再生植株移栽成活率=移栽成活的再生植株数/移栽的再生植株数× 100%； 采用SPSS 25.0和Excel 2010对试验数据进行整理、统计和分析。

2 结果与分析

2.1 植物生长调节剂对茎段愈伤组织诱导的影响

由表1可知 ，不同植物生长调节剂配比的诱导培养基上，山苍子茎段愈伤组织的诱导率均为100%，但愈伤组织褐化率及生长状况存在显著差异。各因素不同水平下极差的大小反应其对山苍子愈伤组织褐化率的影响程度，极差分析发现，对愈伤组织褐化率的影响由高到低依次为6-BA、2,4-D和NAA。6-BA质量浓度的增加导致愈伤组织褐化率显著升高，当6-BA质量浓度为0.2 mg·L-1时，处理1(添加2,4-D)和处理2(添加NAA)的褐化率最低，但二者的愈伤组织状态存在显著差异。处理2诱导的愈伤组织结构致密，诱导量多，而处理1诱导的愈伤组织结构较致密，诱导量少。当6-BA质量浓度为2.0 mg·L-1时，愈伤组织褐化率最高，诱导量极少，生长状态差。

以上结果表明，低质量浓度的6-BA适宜山苍子愈伤组织的诱导，处理2(1/2 MS + 0.2 mg·L-16-BA + 0.3 mg·L-1NAA + 30 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1琼脂)为山苍子茎段愈伤组织诱导的最适培养基，其愈伤组织的诱导率为100%，诱导出的愈伤组织为淡黄色，质地致密，生长量大，生长状态较好，不易发生褐化。将山苍子茎段接种于处理2培养基上培养7天后，茎段两端切口处开始膨大，并出现淡黄色愈伤组织，继续培养21天后，愈伤组织体积增大，质地致密(图1A、B)。

2.2 植物生长调节剂对愈伤组织继代增殖的影响

由表2可知，6-BA对山苍子愈伤组织的增殖系数影响最大，其次为NAA。6-BA质量浓度的增加，导致愈伤组织增殖系数显著降低，在相同6-BA质量浓度下，随着NAA质量浓度的升高，增殖系数呈现逐渐上升的趋势。不同质量浓度6-BA和NAA组合的培养基上，愈伤组织的质地显著不同，其中处理8的愈伤组织为疏松颗粒状，颜色较绿(图2A)，增殖系数最高，达3.80。处理7的愈伤组织质地致密，颜色较暗，有光泽(图2B)，增殖系数为3.43，与处理8差异不显著。当6-BA质量浓度为1.5 mg·L-1时，愈伤组织均表现为疏松水渍状(图2C)，生长状况较差，且随着培养时间的延长，褐化程度逐渐加重甚至死亡(图2D)。在本研究后续的不定芽分化试验中发现，致密型愈伤组织具有再分化能力，可分化出不定芽，而疏松颗粒状愈伤组织增殖系数较高，但不具备再分化能力，且随着继代次数的增加逐渐褐化死亡。

以上结果表明，低浓度的6-BA和高质量浓度的NAA适宜于山苍子愈伤组织的增殖。通过综合比较，处理7和处理8的增殖系数尽管均较高，但处理7诱导形成的愈伤组织致密，生长状况良好，更利于后续分化，因此，处理7(1/2 MS + 0.5 mg·L-16-BA + 1.0 mg·L-1NAA + 30 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1琼脂)为山苍子愈伤组织继代增殖的最适培养基。将生长一致的愈伤组织接种于处理7的培养基上培养7天时，愈伤组织无明显变化，继续培养21天时，愈伤组织体积明显增大，生长状态良好(图1C、D)。

表1 植物生长调节剂对山苍子茎段愈伤组织诱导的影响①

2.3 植物生长调节剂对不定芽分化的影响

由表3可知，当不定芽分化培养基中未添加6-BA和IBA以及IBA质量浓度高于6-BA时，愈伤组织未分化出不定芽。当6-BA和IBA质量浓度均较高时，不定芽分化率和平均不定芽数极低。随着IBA质量浓度的降低，不定芽分化率和平均不定芽数也逐渐升高，当IBA质量浓度为 0.1 mg·L-1时，山苍子不定芽分化率和平均不定芽数均显著高于1.0 mg·L-1的处理。在添加0.1 mg·L-1IBA的处理中，6-BA质量浓度从2.0 mg·L-1降低到0.5 mg·L-1时，山苍子不定芽分化率显著提高，当6-BA质量浓度为0.5 mg·L-1时，不定芽分化率和平均不定芽数均最高，分别为45.59%和8.14。因此，6-BA和IBA质量浓度均较低时，有利于山苍子不定芽分化。

以上结果表明，6-BA和IBA的较低质量浓度配比是山苍子不定芽分化的关键。处理1(1/2 MS + 0.5 mg·L-16-BA + 0.1 mg·L-1IBA + 30 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1琼脂)为山苍子不定芽分化的最适培养基，不定芽分化率最高，为45.59%，分化旺盛，平均不定芽数达8.14，不定芽生长状态较好。将状态良好的愈伤组织接种到处理1的培养基上培养7天时，愈伤组织逐渐出现芽点(图1E)； 培养14天时，愈伤组织体积逐渐变大，表面开始分化出较多不定芽(图1F)； 培养21天时，愈伤组织表面的不定芽明显长大(图1G)； 培养28天时，不定芽生长旺盛(图1H)。

表2 植物生长调节剂对山苍子愈伤组织继代增殖的影响①

图1 山苍子茎段愈伤组织诱导和植株再生过程

表3 植物生长调节剂对山苍子不定芽分化的影响①

图2 山苍子愈伤组织继代过程中的不同质地

2.4 IBA和活性炭对不定芽生根的影响

由表4可知，IBA和活性炭对山苍子不定芽生根率及平均根数具有显著影响。在添加活性炭的培养基中，尽管根生长迅速，但生根率较低，根数少，根细长，长势弱，移栽不易成活(图3A)。在不添加活性炭的培养基中，生根率高，根萌发快，生根数多，根粗壮，移栽易成活(图3B、C)。由此认为，添加活性炭可能不利于山苍子不定芽生根。无论培养基中是否添加活性炭，当培养基中IBA质量浓度从0.2 mg·L-1提高到1.0 mg·L-1时，生根率都呈先升高后降低的趋势(表4)。在不添加活性炭的培养基中，IBA质量浓度为0.5 mg·L-1时的不定芽生根率和平均根数显著高于其他质量浓度(表4)。

综合分析以上结果，选择处理2(1/2 MS + 0.5 mg·L-1IBA + 20 g·L-1蔗糖 + 7 g·L-1琼脂)为山苍子不定芽生根的最适培养基，不定芽生根率达93.33%，平均根数达6.74，根粗壮，再生植株生长健壮。将山苍子不定芽接种于处理2培养基上培养14天时，不定芽茎段皮部开始萌发出根； 培养28天时，根粗壮，长势良好(图1I、J)。

表4 IBA和活性炭对山苍子不定芽生根的影响①

图3 添加活性炭(A)与不添加活性炭(B和C)的培养基上诱导形成的不定根对比

2.5 不同移栽基质对山苍子再生植株移栽成活的影响

由表5可知，不同移栽基质对山苍子再生植株移栽成活具有显著影响。将山苍子再生植株移栽至营养土∶珍珠岩(V/V= 3∶1)的混合基质中时，移栽成活率最高(83.33%)，移栽至其他基质中时，移栽成活率均较低，最低仅为27.78%。因此，将山苍子再生植株移栽至营养土∶珍珠岩(V/V= 3∶1)的混合基质中培养7天后，叶片展开，移栽植株生长状况良好(图1K)，培养28天后，移栽植株生长健壮，植株长高，叶片长大，有新叶长出，无病虫害现象发生(图1L)。

表5 基质对山苍子再生植株移栽成活的影响

3 讨论

植物生长调节剂的种类、质量浓度和配比是影响愈伤组织诱导和增殖以及愈伤组织褐化的关键因素(郎玉涛等， 2007； 李琰等， 2010)。虽然添加适宜浓度的2,4-D有利于多种植物愈伤组织的形成(符文英等， 2004； Leeetal.， 2012； 矫丽曼等， 2017)，但本研究发现NAA更有利于山苍子茎段愈伤组织的诱导和增殖。有研究表明，高浓度的6-BA可刺激愈伤组织产生酚类物质，酚类物质被氧化后产生的醌类物质可抑制愈伤组织的生长(李冬杰等， 2005)。本研究发现，高浓度的6-BA同样易使山苍子愈伤组织发生褐化，导致其死亡，因此，本研究选择较低浓度的6-BA以及适宜浓度的NAA进行愈伤组织的诱导和增殖培养，愈伤组织的诱导率可达100%，愈伤组织在后续培养中也具有较高的增殖系数。

前人研究表明，不定芽分化与不同愈伤组织质地联系密切，只有适宜的愈伤组织质地才能诱导分化出不定芽(张文泉等， 2018)。本研究发现，在山苍子愈伤组织继代增殖过程中，不同培养基上增殖培养的愈伤组织在质地上存在明显差异，只有致密型愈伤组织具有分化能力，随着继代次数的增加仍可不断分化； 而疏松颗粒状愈伤组织和疏松水渍状愈伤组织均不具备分化能力，且随着继代次数的增加逐渐褐化死亡。木本植物培养中愈伤组织分化不定芽是较难的一个环节，不定芽分化率的高低不仅与愈伤组织的质量有关，还需要较高浓度的细胞分裂素和较低浓度的生长素，这不仅取决于植物生长调节剂的种类，还取决于它们之间的比例(谭晓风等， 2013； 辛亚龙等， 2017； 马彦军等， 2017； 袁云香， 2020)。本研究同样发现，当生长素浓度高于细胞分裂素浓度时，有利于山苍子愈伤组织的诱导与增殖； 当细胞分裂素浓度高于生长素浓度时，有利于山苍子不定芽分化。前人对山苍子愈伤组织诱导和植株再生研究中发现，添加为2.0 mg·L-1的6-BA和0.1 mg·L-1的IBA有利于不定芽分化，不定芽分化率为28.57%，平均不定芽数最高为2.86； 当6-BA浓度从2.0 mg·L-1升高至5.0 mg·L-1时，不定芽分化率逐渐降低，愈伤组织褐化死亡率也逐渐升高(林丽媛等， 2013)。而本研究发现，6-BA和IBA的较低浓度配比有利于山苍子不定芽分化。在添加0.1 mg·L-1或0.5 mg·L-1IBA的培养基中，随着6-BA添加浓度的降低，山苍子不定芽分化率及平均不定芽数均逐渐升高。当添加0.5 mg·L-1的6-BA和0.1 mg·L-1的IBA时，不定芽分化率最高，可达45.59%，平均不定芽数可达8.14，显著提高了山苍子不定芽分化率及平均不定芽数。

蔗糖是植物组织培养基的重要成分，其浓度不仅影响愈伤组织诱导、增殖和不定芽分化，也对生根有一定的影响。有研究表明，较低的蔗糖浓度有利于试管苗生根(刘均利等， 2020)。而前人对山苍子不定芽生根培养研究中，在添加浓度为30 g·L-1蔗糖的培养基上，生根率最高仅为45.33%(林丽媛等， 2013)。因此，本研究进行生根培养时，将前人所使用的蔗糖浓度从30 g·L-1降低到20 g·L-1，并添加浓度为0.5 mg·L-1的IBA，显著提高了不定芽的生根率(高达93.33%)，诱导出的根较粗，移栽易成活。此外，培养基中添加活性炭具有吸附酚类等有害物质含量的作用，对许多植物的生根具有一定的促进作用(刘根林等， 2001； Chutipaijitetal.， 2018)。但本研究发现，不添加活性炭诱导出的根较粗，移栽易存活，而添加活性炭诱导出的根萌发较慢，根细长，长势较弱，移栽不易存活，这可能是由于活性炭的吸附作用降低了生长素的浓度而影响山苍子不定芽的生根。

移栽成活是工厂化繁育的关键，而移栽基质是试管苗移栽成活的基础，通常移栽基质要求可以提供根系所需要的养分，并保持一定的含水量(陈宝玲等， 2014)。本研究发现，添加红壤土会使山苍子再生植株移栽不易存活，这可能是由于红壤土易板结，会限制根系生长。而营养土含有大量矿物质和有机质，能为再生植株生长提供所必须的营养。将珍珠岩与营养土混合，可以增加土壤透气性，防止土壤板结，促进根系生长。因此，本研究使用营养土与珍珠岩的混合基质用于山苍子再生植株的移栽，获得了较高的移栽成活率。

4 结论

本研究以山苍子茎段为外植体进行离体培养，建立了植物再生体系，该培养体系显著提高了山苍子不定芽的分化率与生根率，再生植株移栽成活率高，研究结果为山苍子良种的工厂化繁育奠定了基础，也为山苍子遗传转化体系的建立提供了技术支撑。