靶向超声造影剂BR55的研究进展

张馨悦，吕 珂，李建初，姜玉新，孝梦甦

1中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院超声科，北京 1007302北京中医药大学房山医院超声科，北京 102488

BR55是一种与血管内皮生长因子受体2 (vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)特异性结合的靶向超声造影剂，适用范围广，目前已进入临床试验阶段，有望真正进入临床应用。VEGFR2是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的主要受体[1]，在肿瘤新生血管内皮细胞表面高度表达，其表达水平可视为肿瘤预后与转移的指标之一[2]。BR55与VEGFR2特异性结合，且结合能力与VEGFR2表达水平直接相关，可以通过信号强度反应血管内皮细胞上VEGFR2表达水平，引起研究者们的广泛关注。

BR55组成及其成像方式

超声分子成像通过应用靶向超声造影剂在分子水平监测疾病，可用于检测肿瘤内新生血管形成[3]。与非靶向超声造影剂相比，靶向超声造影剂微泡外壳上添加了结合配体，可使其在配体靶向分子的组织位点聚集[4]。根据粒径大小，超声造影剂分为微米级和纳米级。BR55是一种微米级造影剂，不能穿过血管内皮孔进入组织间隙，可有效避免微泡在组织间隙非特异性聚积。而纳米级超声造影剂能穿过血管内皮进入组织间隙，可进行血管外靶组织显像[5]。BR55是检测肿瘤新生血管的诊断性造影剂，除此之外，还有一些多功能靶向造影剂可作为特殊药物或基因的载体[6- 7]。

BR55组成BR55是一种以血管内皮生长因子受体2为靶点的靶向超声造影剂[8]。BR55外壳为磷脂壳，其内为氮气和全氟丁烷的混合物[9]，通过聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)将配体(与VEGFR2有较高亲和力的异源二聚体)与微泡连接[8]。VEGFR2也被称为激酶插入结构域受体(kinase insert domain receptor，KDR)，一种内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体，是肿瘤血管生成的最具特征的分子标志之一[10]。

成像方式超声分子成像的先决条件是区分靶向结合微泡与自由循环微泡[4]。一种方式是利用微泡帧间特征，自由循环微泡可从血管中扩散出去[11- 13]，呈快速、杂乱运动，停留时间较短，而结合微泡缓慢运动或静止，停留时间较长[12]，因而有学者开发新型超声分子成像信号测量算法，将停留时间较长的像素突出显示[14]。另一种方法是破坏-补充法[12]，使微泡进入循环并与靶点结合，然后利用高强度破坏脉冲将所有微泡破坏，靶向微泡结合量可用破坏前信号强度(假定为结合微泡和自由循环微泡)减去破坏后信号强度(假定自由循环微泡可重新填充感兴趣区)来表示[15- 17]，不同微泡所需脉冲强度不同，且高功率破坏性的脉冲可能会造成未经证实的生物效应[14]。

动物实验

大量动物实验证实BR55能与VEGFR2结合。Pochon等[18]在大鼠原位乳腺癌模型中证明BR55与表达VEGFR2的细胞紧密结合，其分布模式与VEGFR2表达模式相关，注射BR55 10 min后，肿瘤血管内积聚的微泡即可突出显示病变，而周围健康组织的信号已恢复到背景值。Wang等[19]利用小鼠鳞状细胞癌模型发现VEGFR2靶向微泡结合力随着VEGFR2密度的增加而增加。

肝癌肿瘤模型VEGFR2在肝细胞癌前病变或高分化肝细胞癌中表达水平显著增高。Grouls等[20]敲除小鼠肝细胞特异性基因模拟人类慢性肝炎、肝细胞不典型增生和肝细胞癌，比较BR55和非靶向二代微泡造影剂BR1(SonoVue，Bracco，Italy)肝脏成像效果，结果显示两者峰值强度无显著差异，但BR55在肝细胞不典型增生中积聚量明显高于正常肝脏，且在注射VEGFR2抗体后，靶向微泡聚集明显减少，BR55中的聚乙二醇可以减少肝脏对大分子造影剂的非特异性摄取[20]。Hackl等[13]在评估小鼠结肠癌肝转移模型时，BR1和BR55均可发现微小病变，BR1发现最小病变为2 mm，BR55发现最小病变为0.8 mm。在非靶向超声造影中，恶性病变特点是门静脉期造影剂低积聚，但转移灶在BR55注射30 min以上仍保持高强化状态，转移灶的BR55强化区域与VEGFR2的表达水平显著相关。

乳腺肿瘤模型研究表明，VEGFR2在乳腺癌病变甚至在导管原位癌时即出现过度表达[8，21]。Bachawal等[8]证明BR55可与转基因小鼠乳腺癌模型中VEGFR2特异性结合，且随着乳腺组织由正常向增生、导管原位癌和浸润性乳腺癌的进展，成像信号显著增强，这与病变中微血管密度和VEGFR2表达水平的增加有关。Bzyl等[22]在裸鼠乳腺癌异种移植瘤模型中，应用BR55的自动三维分子超声成像可精确描绘直径2 mm的微小乳腺癌，在肿瘤增长过程中，成熟血管逐渐增多，VEGFR2表达下降，BR55积聚减少，但亲和力仍足以成像。Helbert等[23]在大鼠乳腺肿瘤模型中检测苏尼替尼(一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂)治疗效果，结果发现BR55在首次给药后12 h即出现显著性差异，而灰阶超声则需要24 h，在治疗72 h后，分子信号峰值强度降低约80%，而解剖参数变化幅度约40%。

其他肿瘤模型与正常胰腺和慢性胰腺炎相比，约半数胰腺肿瘤细胞可以检测到VEGFR表达，包括内皮细胞和导管上皮细胞[24]。Pysz等[25]制作转基因小鼠胰腺导管腺癌模型，使用BR55对病灶进行超声分子成像，胰腺导管腺癌超声信号强度为正常胰腺26.8倍，直径小于3 mm的肿瘤具有更高的VEGFR2靶向超声信号强度，但VEGFR2表达水平没有显著差异，信号强度减低可能与肿瘤直径大于3 mm时功能血管数量及分子靶点数量减少有关。但转基因小鼠胰腺导管腺癌模型在数周内快速进展并不能准确反映实际情况下患者相对缓慢的疾病进展[25]。

在甲状腺乳头状癌中，VEGFR2表达增加与癌细胞增殖、肿瘤大小和是否发生转移相关。Mancini等[16]在转基因小鼠甲状腺癌模型中以VEGFR2靶向造影剂的视频强度差(video intensity difference，VID)量化VEGFR2表达，表明信号强度与VEGFR2表达水平显著相关，VEGFR2靶向微泡在良性病变和正常甲状腺中保留率很低，可用20 VID鉴别甲状腺良恶性结节[16]。

监测肿瘤模型抗血管生成超声造影可评估肿瘤抗血管生成的治疗效果[26]，依据时间强度曲线、动态血管模式、灌注量和相对血容量显示肿瘤内血管形成差异[15，27]。Baetke等[15]在小鼠异种鳞状细胞癌中使用BR55等不同造影剂监测B20(VEGF抗体)抗血管生成治疗效果，通过破坏性脉冲前后超声成像信号声强度差值评估BR55结合量，治疗过程中，BR55微泡结合数量明显减少提示B20抗血管生成的有效性。Wang等[28]证实BR55在监测抗血管生成治疗反应的可行性和重复性，在小鼠异种移植人结肠癌模型中，贝伐单抗抗血管生成治疗后VEGFR2靶向的超声分子成像信号强度相比于对照组降低了57%。尼洛替尼(Nilotinib)是血小板源性生长因子受体抑制剂，DC 101是一种VEGFR2中和抗体，Zafarnia等[17，29]在人类乳腺腺癌细胞诱导小鼠异种肿瘤模型中单独使用尼洛替尼、DC101以及联合两者，根据BR55脉冲破坏前后的信号强度差异，确定VEGFR2结合微泡的信号强度值，从而评估抑制肿瘤血管生成的疗效，结果表明单独使用DC101的VEGFR2表达水平最低，与免疫组化结果相符合。

临床应用试验研究

Smeenge等[9]对24例经活检确诊的前列腺癌患者行BR55超声分子成像，并于30 d内行根治性前列腺癌切除术。在最低剂量为0.03 ml/kg时即可获得整个前列腺的持续增强，在52个恶性病变中，有26个在BR55显像时被发现。VEGFR2是乳腺癌和卵巢癌等多种肿瘤组织中新生血管生成的关键调节因子之一[8，10，28]，Willmann等[11]应用BR55对乳腺和卵巢病变患者进行超声分子成像，自由循环微泡消失后仍可见的增强病灶代表靶向微泡与VEGFR2的结合，将病灶增强程度分为强、弱、无3个视觉等级，结果显示VEGFR2靶向超声分子成像信号与VEGFR2表达水平相匹配，大多数卵巢原发恶性病变表现为明显强化，大多数卵巢原发良性病变表现为无强化；乳腺恶性病变VEGFR2靶向超声信号强度高于周围正常乳腺组织约8倍。

关于BR55的注射剂量，也开展了一些相关研究。Smeenge等[9]提出患者注射2次，剂量分别为0.03、0.05 ml/kg，最大累积剂量为0.08 ml/kg。当注射剂量为0.01、0.02 ml/kg时不能提供足够的诊断信息。Willmann等[11]在3组患者中分别以0.03、0.05、0.08 ml/kg注射1次，发现不同剂量组信号持续时间无显著差异，最早可在注射后7 min被观察到。

问题与展望

虽然BR55已经进入临床试验阶段，但仍有一些问题亟需解决，如：靶向结合微泡和自由循环微泡的区分尚无统一标准。BR55在人体前列腺癌、卵巢癌及乳腺癌临床研究中虽未出现严重不良反应[9，11]，但患者偶有轻、中度不良反应，无任何干预即可恢复正常。近年来，多靶点超声分子成像也是新的研究方向，例如VEGFR2和αvβ3整合素是肿瘤血管生成的两个最具特征的分子标志物，Willmann等[30]应用VEGFR2和αvβ3整合素为靶点的双靶向超声造影剂，在血管生成部位检测到更高的附着水平和超声成像信号。除此之外三维超声分子成像也拥有广阔的应用前景。

结 语

BR55是一种可与血管内皮生长因子受体2特异性结合的靶向超声造影剂，适用范围广、不良反应少，有望最早应用于临床，因此有必要了解其原理及应用现状。截至目前，已通过多种动物实验证明其结合能力与VEGFR2表达水平直接相关，并在人体前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌病变中证明其有效性、安全性及耐受性。