藜麦活性蛋白的制备及抗结肠癌效应评价

加 英，张雪琛，史江颖，单树花，李卓玉，*

（1 山西大学生命科学学院 太原030006 2 山西大学生物技术研究所 化学生物学与分子工程教育部重点实验室 太原 030006）

结肠癌（Colorectal cancer，CRC）是一种消化道恶性肿瘤，是世界范围内最常见的癌症，严重危害人类健康和安全[1-2]。据2018 年全球癌症数据统计，结肠癌的发病率和死亡率分别居于第3 位和第2 位[3]，其发病率预计在未来的几十年内持续增加[4]。目前临床上对于结肠癌采用以手术为主、药物化疗为辅的综合治疗方式，这种治疗方式具有一定的局限性，可能会引起肿瘤细胞转移，还会产生极大的耐药性及毒副作用，损坏正常脏器，给患者带来二次伤害。寻找绿色、高效和低毒的预防结肠癌的功能食品是目前研究者的关注点。

藜麦（Chenopodium quinoa willd.）又称金谷子，是一种一年生草本开花植物，属藜科藜属[5]。近年来，藜麦在山西省大规模种植，主要分布在忻州市、朔州市等地区。在营养学领域，藜麦有“全营养食品”的美称，富含人体所需的全部营养物质，与日常食用的大多数粮食谷物，如小麦、玉米、稻米、高粱等相比营养和食用价值更高，被誉为“超级谷物”，是世界范围内极具发展潜力和保健功效的农作物之一[6]。数千年来，人们一直在日常饮食中摄入藜麦，旨在预防多种疾病并降低各种疾病的发病风险[7]。藜麦能产生具有多种生物活性的次生代谢产物，在过去40 年里，从藜麦中鉴定出至少193 种次级代谢产物，主要包括皂苷、酚酸类、黄酮类、萜类、甾醇类和含氮化合物[8]。这些代谢产物中富含多种生物活性物质，可有效预防和改善炎症、心血管疾病、高血糖、高血压、骨质疏松症等多种慢性疾病[9]，对人们的健康有极大的益处。藜麦中的一些功能分子还有抗菌[10]、抗癌[11]、抗氧化[12]、细胞毒性[13]、抗糖尿病[14]和抗炎[15]等营养功效。此外，藜麦中蛋白质含量高，氨基酸比例合理，特别是含有普通谷物中最容易稀缺的赖氨酸（4.6%～6.6%）及蛋氨酸（0.4%～1.0%），具有较高的保健功效。目前提取藜麦蛋白多采用碱提酸沉的方法[16]，即先在碱性溶液中浸提，后在酸性条件下沉淀蛋白，并通过生物化学手段获得藜麦活性肽，如：蛋白酶解法[17]、微生物发酵法[18]及模拟消化法[19]等，若酸、碱操作不慎会引起蛋白的变性，进而影响蛋白的生物活性，然而，目前通过无机盐沉淀来获取高生物活性的藜麦蛋白鲜见报道。

基于此，本研究以山西特色藜麦资源为原料，利用丙酮-硫酸铵沉淀法提取藜麦蛋白，结合Q柱分离纯化出具有抗结肠癌活性的藜麦蛋白，将其命名为WQP。在细胞水平探讨WQP 的抗结肠癌活性，分别从细胞增殖、细胞凋亡及细胞迁移3个方面评价WQP 的抗结肠癌活性。本研究揭示了藜麦活性蛋白抗结肠癌的分子机制，为开发藜麦源活性蛋白抗结肠癌候选药物及其营养干预相关产品的研发提供科学依据和物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藜麦购自山西省忻州市静乐县农贸市场。

人结肠癌细胞株DLD1、HCT-8 及正常结肠上皮细胞FHC 均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

RPMI-1640 培养基、胎牛血清，购买于GBICO 公司；噻唑蓝（MTT）、EDTA、青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液（100×三抗）、二甲基亚砜（DMSO）、SDS，购买于索莱宝科技有限公司；结晶紫、G-250、胰蛋白酶，购买于碧云天生物技术有限公司；丙酮、甲醇（分析纯级）、冰醋酸、异丙醇、（NH4）2SO4（分析纯级），购自天津市风船化学试剂科技有限公司；Q-柱材料，购自GE 公司。

1.2 仪器与设备

电子天平，美国Ohaus 公司；破壁料理机，九阳股份有限公司；CO2细胞培养箱、冷冻高速离心机，德国Eppendorf 公司；医用冷藏箱，长虹美菱股份有限公司；pH 计，上海三信仪表厂；超净工作台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；倒置显微镜，日本尼康株式会社；紫外-可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；酶标仪，瑞士TECAN 公司。

1.3 方法

1.3.1 藜麦蛋白的制备 采用MTT 法检测抗结肠癌活性。将有抗结肠癌活性的组分洗脱液蛋白命名为WQP，最后经冷冻干燥得到藜麦蛋白粉末。将藜麦全谷粉碎并过60 网目筛，取上述粉末30 g，按料液比1∶10 的比例溶于预冷的20 mmol/L Tris-NaCl（0.85%）蛋白提取液中，4 ℃搅拌过夜。在4 ℃、11 000 r/min 条件下离心25 min，取上清，加入二倍体积预冷丙酮，充分搅拌均匀后于-40℃冰箱沉淀2 h，11 000 r/min 离心25 min，留沉淀。将沉淀置于-40 ℃条件下挥发丙酮，加入预冷的20 mmol/L Tris-HCl 溶解，离心取上清。根据硫酸铵饱和度表加入饱和度为90%的硫酸铵，于4℃静置30 min 后于4 ℃、11 000 r/min 条件下离心25 min，留沉淀。沉淀用预冷的20 mmol/L Tris-HCl 溶解，置于4 ℃透析除盐，冷冻干燥后得到藜麦蛋白。

图1 藜麦蛋白制备流程图Fig.1 Flow chart of quinoa protein preparation

1.3.2 藜麦蛋白的分离纯化 采用Q-强阴离子交换层析分离纯化藜麦蛋白。用20 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）平衡Q 柱，将藜麦蛋白溶解上样，与柱材料结合2～3 h，依次用100，150，200，300 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-氯化钠（Tris-Na-Cl）（pH 8.0）洗脱层析柱，分别收集洗脱液并分别浓缩洗脱液，用紫外分光光度计在波长595 nm 处检测，计算蛋白浓度，进一步在细胞水平检测Tris-NaCl 各梯度洗脱蛋白液的抗结肠癌活性，将具有抗结肠癌活性的组分命名为WQP。

1.3.3 藜麦蛋白的抗肿瘤活性检测 取对数生长期的结肠癌细胞DLD1、HCT-8 及人正常结肠上皮细胞FHC，按细胞密度为6 000～8 000 个/孔接种于96 孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，加入终质量浓度为0，60，90，120，150 μg/mL 的WQP，每个梯度设置5 个复孔。处理24 h 后吸弃旧培养基，PBS 洗1～2 次，换新鲜培养基，每孔加入20 μL MTT 处理4 h。将上述培养液吸弃，加入150 μL DMSO 在振荡摇床上振荡10 min，用酶标仪测定波长570 nm 处的吸光度值，并计算细胞存活率。

1.3.4 细胞克隆形成试验 取对数生长期结肠癌细胞DLD1、HCT-8 按5×103个/孔接种于24 孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，用终质量浓度为0，60，90，120 μg/mL 的WQP 处理细胞5 d，吸弃旧培养基，用预冷的甲醇室温固定细胞30 min。弃掉固定液，0.1%结晶紫染液染色15 min，37 ℃烘箱烘干后在显微镜下进行拍照。每孔加入100 μL 1%的SDS 振荡溶解，用酶标仪在波长570 nm 处测定吸光度值进行量化分析。

1.3.5 细胞形态学试验 取生长状态较好的结肠癌细胞DLD1、HCT-8 用胰酶消化，调整细胞密度，按5×103个/孔接种到24 孔细胞培养板，待细胞贴壁后，加入终质量浓度为0，60，80，100，120 μg/mL 的WQP 处理24 h，用尼康显微镜拍照并记录细胞数量及形态。

1.3.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 选取对数期HCT-8 细胞，以105个/孔的细胞密度接种于6 孔板，待细胞贴壁后加入终质量浓度为0，90 μg/mL的WQP 处理细胞24 h，加0.25%胰酶（不含EDTA）消化并离心收集细胞，PBS 洗2 次，加入1×结合缓冲液100 μL 重新吹散悬浮细胞，加入5 μL磷脂结合蛋白带绿色荧光（Annexin V-FITC）和5 μL 碘化丙啶（PI）结合溶液，轻轻吹打使完全混匀，在室温下避光孵育15 min。向上述体系中加入400 μL 1×结合缓冲液轻微摇匀，用流式细胞仪检测。

1.3.7 细胞划痕试验 选取对数期DLD1、HCT-8细胞，按90%左右的单层细胞密度接种于24 孔细胞培养板中的无菌牛津杯内。待细胞贴壁后，标记细胞所在的位置，用无菌镊子夹取出牛津杯，用200 μL 的无菌枪头在标记的圈内均匀划痕，划痕结束后每孔补加500 μL PBS，在显微镜下拍照记录0 h 的划痕距离。吸掉PBS，每孔加500 μL 新鲜培养基，同时加入终质量浓度为0，10，20 μg/mL的WQP 处理细胞24 h，每个质量浓度设置3 个复孔。显微镜拍照并记录24 h 的划痕距离，计算细胞迁移率。

迁移率（%）=（0 h 划痕距离-24 h 划痕距离）/0 h 划痕距离×100

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 藜麦蛋白的活性检测

采用MTT 法检测抗结肠癌活性，结果如图2所示，使用1.3.2 节中所得的不同蛋白洗脱组分分别处理DLD1 和HCT-8 结肠癌细胞时，仅100 mmol/L Tris-NaCl 洗脱组分具有显著抑制结肠癌细胞增殖的活性，其对DLD1 和HCT-8 细胞的抑制率分别为（69.3±8.3）%和（72.2±6.1）%，其它组分的藜麦蛋白洗脱在100 μg/mL 时均没有明显的抗结肠癌活性。综上，选用100 mmol/L Tris-NaCl洗脱组分，作为藜麦蛋白发挥抗结肠癌细胞活性的主要组分（命名为WQP），进一步评价其抗结肠癌的效应。

图2 藜麦蛋白的活性检测Fig.2 Activity detection of quinoa protein

2.2 WQP 抑制人结肠癌细胞DLD1、HCT-8 的增殖

为了进一步确定藜麦活性蛋白WQP 的抗结肠癌细胞增殖活性，用不同质量浓度的WQP（0，60，90，120，150 μg/mL）处理结肠癌细胞DLD1、HCT-8 和正常结肠上皮细胞FHC 24 h 后，采用MTT 法检测细胞存活率。图3a 和3b 显示，藜麦蛋白WQP 可以明显抑制两种结肠癌细胞的增殖，并呈现出质量浓度梯度依赖性；图3c 则显示WQP对正常结肠上皮细胞FHC 的细胞增殖并不影响。表1 数据显示了不同质量浓度WQP 处理结肠癌细胞DLD1、HCT-8 及正常结肠上皮细胞FHC 后，经SPSS 回归概率分析计算出WQP 对DLD1 和HCT-8 的IC50值分别为122 μg/mL 和128 μg/mL。以上结果揭示了WQP 可以显著抑制结肠癌细胞的增殖。

表1 WQP 对不同结肠细胞的半抑制浓度Table 1 The half maximal inhibitory concentration of WQP on different colon cells

图3 藜麦活性蛋白WQP 对不同结肠细胞增殖的影响Fig.3 Effects of WQP on cell proliferation of different colon cells

2.3 WQP 抑制人结肠癌细胞DLD1、HCT-8 细胞克隆形成能力

为了进一步确定WQP 的抗增殖效应，采用平板克隆试验检测WQP 对DLD1 和HCT-8 细胞克隆形成能力的影响。图4a 显示，WQP 处理5 d 后，对结肠癌细胞集落的形成有明显的抑制作用，与对照组相比，两种结肠癌细胞的克隆能力均被WQP 显著抑制。图4b 和4c 分别定量分析了DLD1 和HCT-8 细胞克隆形成能力，结果显示当WQP 的营养干预质量浓度为90 μg/mL 时，DLD1的细胞存活率为42.6%，HCT-8 的存活率仅为27.4%，且均具有质量浓度梯度依赖性。以上结果表明WQP 能够显著抑制结肠癌细胞的克隆形成能力。

图4 WQP 对DLD1、HCT-8 细胞活力的影响Fig.4 The effect of WQP on the activity of DLD1 and HCT-8 cells

2.4 WQP 对人结肠癌细胞DLD1、HCT-8 细胞形态的影响

为了验证WQP 对结肠癌细胞的抗增殖效应，用不同质量浓度WQP（0，60，80，100，120 μg/mL）营养干预DLD1 和HCT-8 细胞24 h，在倒置显微镜下观察细胞的生长状态。图5 显示，在60 μg/mL处理条件下，与对照相比，随着WQP 质量浓度的升高，大量细胞在形态上发生了明显的变化，细胞逐渐皱缩变圆，且数量显著减少。以上结果表明WQP 能够通过改变结肠癌细胞形态和抑制结肠癌细胞数量来发挥抗增殖效应。

图5 WQP 处理对细胞形态的影响Fig.5 Effects of WQP treatment on cell morphology

2.5 WQP 对人结肠癌细胞凋亡的影响

为了探讨WQP 对结肠癌细胞增殖的抑制作用与细胞凋亡的关系，选取对WQP 抑制较敏感的结肠癌HCT-8 细胞，采用流式细胞仪检测不同质量浓度WQP 处理24 h 对HCT-8 细胞凋亡的影响。图6a 显示，用90 μg/mL 的WQP 处理HCT-8细胞后，凋亡率显著增加，其凋亡率为19.47%；如图6b 细胞凋亡率统计图所示，与对照组相比凋亡率增加了近2 倍。该结果表明WQP 能够诱导HCT-8 细胞凋亡，从而减缓结肠癌细胞的增殖。

图6 WQP 处理对HCT-8 细胞凋亡的影响Fig.6 Effects of WQP treatment on apoptosis of HCT-8 cells

2.6 WQP 对人结肠癌细胞迁移的影响

从细胞迁移的角度进一步探究WQP 的抗结肠癌效应，采用细胞划痕法检测不同质量浓度WQP（0，10，20 μg/mL）对2 种结肠癌细胞DLD1及HCT-8 迁移的影响。图7a 显示，WQP 处理细胞24 h 后能够显著抑制DLD1 和HCT-8 细胞的迁移，且在20 μg/mL 的WQP 处理后抑制作用更加明显，图7b 统计迁移率分别为33%和37%。采用MTT 法检测与划痕试验相同质量浓度的WQP对两种结肠癌细胞的增殖情况，发现WQP 对DLD1 和HCT-8 两种细胞的增殖效应均没有明显的抑制作用（图7c），最高抑制率均为5%以内，排除了细胞增殖效应对细胞迁移所产生的影响。以上结果揭示WQP 具有抑制结肠癌细胞迁移的效应。

图7 WQP 处理对DLD1 及HCT-8 细胞迁移的影响Fig.7 Effects of WQP treatment on migration of DLD1 and HCT-8 cells

3 讨论

近年来从植物中提取的天然活性物质在预防人类疾病发生方面得到了越来越多的关注。目前已有研究者从多种植物中提取获得具有抗肿瘤活性的蛋白，如植物来源的凝集素[20-22]、过氧化物酶（POD）[23]、核糖体失活蛋白（RIPs）[24]等，这些蛋白可通过阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡来抑制癌细胞增殖，提示谷物来源的活性蛋白有望开发成为预防肿瘤的特医食品。

已有研究表明，藜麦蛋白及肽不仅具有抗氧化、降血压、降血糖等免疫调节活性[25-27]，在消化处理后还具有抗肿瘤的活性。Vilcacundo[28]等于2018年研究发现，藜麦蛋白的体外模拟消化产物中>5 ku 的肽具有抗结肠癌的生物活性；Ayyash 等[29]研究发现全谷物羽扇豆、藜麦和小麦发酵后产物对结肠癌细胞Caco-2 和乳腺癌细胞MCF-7 肿瘤细胞具有显著的抗增殖活性，且随着发酵时间的增加，对肿瘤细胞的抑制率也逐渐增加，此外，还兼具抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶、抗高血压、抗氧化和蛋白水解的活性。上述研究均将藜麦蛋白进行消化或发酵后产物进行抗肿瘤活性分析，本研究与上述研究的不同在于，采用丙酮-硫酸铵沉淀法从山西特色资源藜麦全谷中获得了未经消化且具有抗结肠癌活性的蛋白组分，将其命名为WQP，通过MTT 试验初步揭示了其具有显著的抗结肠癌活性（图2）。进一步在细胞水平采用细胞增殖试验、细胞平板克隆形成试验、细胞凋亡及细胞迁移试验对WQP 的抗结肠癌效应进行了一系列评价。研究结果表明：WQP 对结肠癌细胞的增殖及克隆形成能力有明显的抑制作用（图3～4），且能够通过诱导HCT-8 细胞凋亡进而抑制细胞增殖（图6）；同时，WQP 能够显著抑制结肠癌细胞的迁移（图7），揭示WQP 能够从抑制结肠癌细胞增殖、促进结肠癌细胞凋亡、阻滞结肠癌细胞迁移3 个方面来发挥抗结肠癌效应。

以上结果完善了藜麦蛋白在抗结肠癌方面的研究，下一步将进一步纯化藜麦蛋白WQP，以确定WQP 中单一活性蛋白的抗结肠癌作用靶点，从细胞增殖、凋亡和迁移的角度阐明WQP 及其单一活性蛋白的抗结肠癌分子机制，为藜麦营养物质在结肠癌防控方面的应用提供可靠的理论数据，进一步拓展了藜麦资源的综合利用和有效开发。

4 结论

本研究以山西特色藜麦资源为原料，利用丙酮-硫酸铵沉淀法提取藜麦蛋白，结合Q 柱分离纯化出具有抗结肠癌活性的藜麦蛋白WQP。进一步在细胞水平探讨WQP 的抗结肠癌活性，分别从细胞增殖、细胞凋亡及细胞迁移3 个方面进行评价，研究结果表明：WQP 能够诱导结肠癌细胞凋亡，从而抑制细胞增殖；另外，WQP 能够显著阻滞结肠癌细胞的迁移效应，表明WQP 具有显著的抗结肠癌活性。本文为深入阐明WQP 抗结肠癌的分子机制提供了试验基础，并为藜麦营养物质在结肠癌防控方面的应用提供基础数据，对藜麦资源的开发利用具有深远意义。