内质网应激—凋亡途径与卵巢衰老关系研究进展

苏娜，蔡平平，严如根，李长忠 ，曹云凤

1 山东中医药大学第一临床医学院，济南 250014；2 山东第一医科大学附属省立医院妇科；3 山东第一医科大学附属省立医院中医科；4 山东第一医科大学附属省立医院检验科

卵巢衰老指女性卵巢储备功能逐渐衰退直至衰竭的过程，表现为卵泡数量减少和卵母细胞质量下降，从而影响卵巢内分泌功能和生育能力。据其进展程度、出现年龄等方面的不同，临床将其分为卵巢储备功能减退（DOR）、早发性卵巢功能不全（POI）及卵巢早衰（POF）等疾病。卵巢衰老被喻为女性机体衰老的起搏器，是多个器官衰老的始动因素。因此，对于卵巢衰老的早期识别和干预至关重要。卵泡的生长发育需要卵母细胞和颗粒细胞（GCs）的相互作用。卵泡闭锁是哺乳动物卵巢GCs和卵母细胞丢失及卵巢衰老的主要过程之一，其中GCs 凋亡是卵泡闭锁的前提，且凋亡与否直接影响卵母细胞的发育潜能。因此，二者的凋亡是卵泡闭锁卵巢衰老的关键。内质网应激（ERS）-凋亡途径作为近几年新发现的凋亡路径，被证实参与卵泡的生长发育闭锁，但在卵巢衰老中的具体作用机制尚存争议，值得进一步研究探索。针对ERS-凋亡途径的靶向干预治疗也有望成为临床预防或延缓卵巢衰老的创新治疗方法。本文就ERS-凋亡途径与卵巢衰老发生发展的关系作一综述，以期为卵巢衰老发病机制提供思路，亦为其寻找新的潜在治疗靶点。

1 ERS-凋亡途径的诱因与卵巢衰老的关系

卵巢衰老是一个受多因素影响的复杂生物学过程，目前病因仍不明确。年龄、环境、生活方式、医源性、免疫等因素均可通过直接或间接途径损害卵泡数量和质量，导致卵巢储备功能下降，加速卵巢衰老进程，但不同影响因素在机制方面可能有相通之处。例如，各病理因素（如氧化损伤、炎症反应等）均可激活ERS，触发促凋亡途径，诱导加速GCs或卵母细胞凋亡，最终导致卵巢衰老。

1.1 氧化应激 ERS与氧化应激相互作用，共同介导细胞凋亡过程，参与多种疾病的发生发展。高血糖是卵巢功能异常的主要致病因素，先前的报道大多认为糖尿病可引起氧化应激并导致DNA 损伤，进一步引发细胞周期停滞并致GCs 凋亡，从而抑制卵母细胞成熟［1］。而 WU 等［2］却认为除诱导 DNA 损伤外，糖尿病还可通过诱导氧化应激进而激活ERS，以加速卵巢GCs 凋亡。这与镉诱导GCs 凋亡［3］的病理机制高度吻合。

1.2 Ca2+稳态失衡 理论上，维持GCs 的正常生理功能依赖于内质网（ER）的Ca2+稳态，而Ca2+可能是卵巢GCs 中ERS 的诱发因素之一［4］。跨膜结构和卷曲螺旋结构域1蛋白（TMCO1）是一种ER跨膜蛋白，可主动防止Ca2+储存过度填充。TMCO1敲除的雌性小鼠多表现为卵巢卵泡发育受损以及类似于POF表型的生育力低下，提示TMCO1对维持卵巢卵泡发育和生育能力至关重要；其破坏可造成GCs 中Ca2+稳态失衡，加速ERS 介导的细胞凋亡，从而导致卵巢卵泡发育受损［4］。有研究报道，UFL1 基因负责启动卵巢GCs中的ERS和卵巢早衰；究其本质，也与其抑制TMCO1 通道，破坏Ca2+稳态，进而启动ERS-凋亡途径相关［5］。

双氢青蒿素（DHA）作为青蒿素的重要衍生物，可通过诱导凋亡、调控细胞周期、加速细胞氧化损伤等发挥抗肿瘤作用。然而，LUO 等［6］的研究结果却显示DHA 暴露可导致GCs 中ATP 浓度增加，葡萄糖调节蛋白78（GRP78）转录水平提高；因此推测DHA可通过增加细胞内Ca2+的产生，扰乱Ca2+稳态引发ERS，进而诱导GCs凋亡。

1.3 炎症反应 卵巢储备功能与卵巢炎症密切相关，持续的炎症可加速卵巢衰老，减少卵巢储备。核转录因子κB（NF-κB）是炎症调节的关键因子，NF-κB 信号通路对于维持卵泡发育、GCs 正常生理功能不可或缺。LUO 等［7］的研究首次阐释了 NF-κB 信号通路在POF 发展中的影响，即NF-κB 信号失活可通过GRP78 引起的ERS 失衡加速GCs 凋亡，进一步导致窦性卵泡减少并最终导致POF。

2 ERS-凋亡的途径与卵巢衰老的关系

氧化损伤、炎症反应等不同病理因素均可激活ERS-凋亡途径，诱导加速GCs 或卵母细胞凋亡，导致卵巢储备功能下降，然而不同因素导致的卵巢衰老可由不同ERS-凋亡途径介导。

2.1 CHOP 途径与卵巢衰老 CHOP 是 ERS-凋亡途径的重要组成部分，也被称为生长阻滞和DNA 损伤诱导基因153（GADD153）或DNA 损伤诱导转录基因（DDIT3），属于CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPs）家族，其过表达可使细胞周期停滞并导致细胞凋亡。CHOP 缺陷模型中ERS 诱导的细胞凋亡明显减少［8］。总之，CHOP在促进ERS诱导的细胞凋亡中起重要作用，且主要通过蛋白激酶R 样内质网激酶（PERK）/真核起始因子2α（eIF2α）/ATF4 信号和（或）活化转录因子6（ATF6）信号诱导启动。近年来，由CHOP 途径诱导的细胞凋亡与妇科疾病的相关性备受关注。LIN 等［9］研究了 CHOP 和 GRP78 在山羊闭锁卵泡中的定位，发现在早期或进展闭锁卵泡的GCs 中均检测到二者的存在；随后的机制研究进一步证实，未折叠蛋白质反应（UPR）的PERK/eIF2α/ATF4及ATF6信号通路均参与了卵泡闭锁的病理过程，并通过上调CHOP 表达启动GCs 凋亡以致卵泡闭锁，从而损伤卵巢功能。

PERK 是一种跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶，在ERS中通过自身二聚化和磷酸化激活。有活性的PERK可磷酸化真核起始因子 2α（eIF2α），减弱mRNA 翻译，抑制蛋白质的合成；磷酸化的eIF2α 进一步激活转录激活因子4（ATF4）的翻译，刺激下游促凋亡因子CHOP 的表达，从而加速细胞凋亡。一项研究表明［3］，大鼠卵巢 GCs 用镉处理 12 h 后，可观察到 p-PERK、p-eIF2α、CHOP mRNA 和蛋白水平上调，提示镉诱导的GCs凋亡可能是通过激活ERS的PERK/peIF2α/ATF4/CHOP 通路介导的。DHA 诱导的生殖毒性机制与其相似，通过激活PERK/eIF2α/ATF4分支而致GCs凋亡［6］。

CHOP 也是ATF6 的主要下游靶标。作为ERS信号传导的关键参与者，ATF6 可从调节GCs 凋亡、细胞周期、类固醇激素合成等多方面影响卵泡发育。蓝藻代谢产生的微囊藻毒素LR（MC-LR）不仅可以直接作用于卵巢、睾丸等生殖器官，还可通过破坏下丘脑—垂体—性腺轴间接影响性激素，具有严重的生殖毒性。暴露于MC-LR 的小鼠性腺指数降低，同时伴随 DDIT3、ATF6、肌醇需求因子1（IRE1）表达的上调。这提示除IRE1通路以外，MC-LR诱导的GCs 凋亡和卵泡闭锁还可能与ATF6 凋亡途径有关［10］。

2.2 JNK 途径与卵巢衰老 JNK 介导的凋亡通路主要由IRE1 信号启动。与PERK 和ATF6 相似，IRE1 作为ER 的压力传感器，在应激状态下与GRP78 分离后自磷酸化以激活其核酸内切酶活性。肌醇需求因子1α（IRE1α）被激活后，启动转录的特异性剪接 X 盒结合蛋白 1（XBP1）mRNA，剪接的XBP1 mRNA 编码功能蛋白XBP1s，并通过抑制蛋白质翻译解决未折叠蛋白的超载问题进而恢复细胞稳态。然而，过度或持续的ERS仍会触发细胞凋亡。

目前，许多因素所致的GCs 凋亡均与IRE1α/JNK 信号通路的激活相关。在POF小鼠卵巢中观察到 IRE1α、XBP1 及 GRP78 蛋白水平显著上调，表明IRE1α 信号通路过度激活可能是诱导POF 小鼠GCs凋亡的关键机制［11］。此外，MA 等［12］首次发现MC-LR 可显著激活 IRE1 通路（IRE1、XBP1 和 JNK）诱导卵巢损伤，为MC-LR 的生殖毒性提供了新见解。然而，在GalT-/-诱导的卵巢老化小鼠模型中，伴侣分子免疫球蛋白结合蛋白（BIP）、PERK 和peIF2α 均升高，然而并未诱导 IRE1α 激活下游的XBP1，推测UPR的PERK分支而不是IRE1α 分支在GalT-/-卵巢中被激活。

此外，活化的IRE1 不仅具有核酸内切酶活性，同时也有激酶活性，可介导肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF2）的激活，刺激凋亡信号调节激酶1（ASK1）/JNK 级联效应，从另一途径介导细胞凋亡［13］。IRE1/ASK1/JNK 通路属于 ERS-凋亡途径的重要一环，并参与多种疾病的病理过程。例如，地诺孕素诱导的ERS 通过激活IRE1/TRAF2/ASK1/JNK信号传导增加CHOP 表达，从而影响子宫内膜异位症基质细胞的凋亡、增殖和侵袭［14］；熊果酸诱导ERs激活ASK1-JNK 信号，并诱导人膀胱癌T24 细胞凋亡［15］。但是，此凋亡途径是否参与卵巢衰老的发生发展仍未可知，可以作为下一步的研究重点。

2.3 Caspase-12 途径与卵巢衰老 Caspase 是一个保守的半胱氨酸蛋白酶家族，在程序性细胞死亡和炎症中起关键作用［16］。其中Caspase-12 作为Caspase 家族成员之一，定位于ER，属于ERS 的特异性信号分子。正常情况下，Caspase-12 处于无活性状态，只有在某些特定条件下才被ERS 激活进而启动凋亡程序，且不参与线粒体途径和死亡受体途径介导的凋亡，缺乏Caspase-12 的小鼠对ERS 诱导的细胞凋亡具有明显抗性。

以不同方式诱导的卵巢衰老小鼠为模型，研究Caspase-12 途径在此病理过程中发挥的作用。不管在免疫诱导的POF 小鼠卵巢组织中［16］，或在体外暴露于多柔比星的小鼠卵母细胞中，均发现Caspase-12表达水平明显升高。多溴联苯醚（PBDEs）是一种广泛存在于环境中的新型持久性有机污染物，可作用于人体不同靶器官发挥毒性效应。生殖毒理学实验表明，2，2′，4，4′-四溴联苯醚（PBDE-47）属于PBDEs 的主要同系物，可在人体中蓄积且具有明显生殖毒性［17］；同样PBDE-47 暴露可降低小鼠卵巢系数，且增加 GRP78、Caspase-12 等 ERS 标志物的表达，诱导细胞凋亡［18］。而另一项以半乳糖诱导的卵巢衰老小鼠为模型的研究则发现，参与ERS 通路的CHOP、Caspase-12 及与促凋亡相关的Bax 蛋白水平均升高［19］。此外，OKAN 等［20］发现，在糖尿病患者的卵巢中，UPR 通过 Caspase-12 和 Caspase-3 的共激活触发凋亡级联反应，诱导细胞凋亡。以上体内外实验均表明，ERS 介导的Caspase-12 特异性凋亡途径可能在不同因素所致的卵巢细胞凋亡中发挥作用。

3 ERS-凋亡途径的调控与卵巢衰老防护

ERS 介导的凋亡与卵巢衰老关系密切，因此基于调控ERS-凋亡途径以改善卵巢功能的潜在治疗药物和靶点也需进一步开发研究。其中，某些化合物或干预措施已被证实可通过靶向处理通路关键因子等缓解ERS，进而改善细胞凋亡并延缓卵巢衰老。

BALAKRISHNAN 等［21］用Salubrinal（一种eIF2α磷酸酶抑制剂）治疗GalT-/-小鼠，发现UPR 相关因子 BIP、p-PERK 和 p-eIF2α 表达水平均下调。这表明Salubrinal 的卵巢功能保护机制可能与ERS-凋亡路径相关，尤其是PERK/eIF2α 通路。过氧化物还原酶4（Prdx4）作为一类抗过氧化物酶，主要定位在ER，可消除过氧化氢、抑制氧化应激并促进氧化蛋白质折叠［22］。在d-gal诱导的卵巢衰老小鼠模型中，Prdx4 缺乏会通过增加卵泡闭锁和HPO 轴障碍等加速卵巢衰老；反之，Prdx4 可通过抑制ERS 相关凋亡途径，尤其是CHOP 及Caspase-12 途径，抑制卵巢GCs 凋亡，减缓小鼠卵巢衰老进程，可作为一种POF保护剂［19］。在体外研究中，邹小飞等［23］通过免疫荧光共定位明确Prdx4 定位于GCs 内质网，下调Prdx4蛋白表达可引起GCs 的ERS，从而促进GCs 凋亡，表明Prdx4 作为ER 抗氧化剂，可通过维持蛋白质稳态，下调ERS 水平，从而抑制GCs 的凋亡。此外，Protegrin-1（一种抗菌肽）可通过 PERK/eIF2α/CHOP 信号通路抑制氧化应激引起猪卵巢GCs 凋亡［24］；褪黑素可使暴露于镉的卵巢ERS 相关蛋白GRP78、ATF4、CHOP 和 p-JNK 表达下调，减轻细胞毒性，减少GCs凋亡，提示褪黑素可以成为保护卵巢免受镉毒性影响的潜在药物［25］。而在皮下注射透明带抗原3（ZP3）诱导的自身免疫性POF 小鼠模型中，人胎盘间充质干细胞（hPMSCs）移植可明显下调IRE1α、XBP1、GRP78及Caspase-12表达；因此，该研究推测hPMSCs 移植可能通过抑制IRE1α 通路的过度激活，减少GCs凋亡，改善卵巢功能［11］。上述系列实验表明，预处理ERS-凋亡途径或靶向处理通路关键蛋白，可显著降低ERS 相关基因表达，抑制卵巢细胞凋亡，改善卵巢功能。

综上所述，在不同因素所致卵巢衰老的发生、发展过程中都有ERS-凋亡途径的参与。ERS 与氧化应激、炎症因子、Ca2+稳态失衡等病理因素相互影响，并主要从 CHOP、JNK、Capcase12 三条经典凋亡途径共同参与介导卵巢细胞凋亡。因此，临床上如何有效调节ERS-凋亡途径中关键蛋白的表达，改善ERS状态从而减少细胞凋亡，保护卵巢功能，将为卵巢衰老的防治提供潜在的靶向治疗方向。近年来大量研究发现，中医药可以通过多途径、多靶点对ERS-凋亡途径进行调节进而治疗各种疾病，具有很大的治疗潜力。例如，补肾解郁调冲方通过PERKATF4-CHOP 信号通路降低多囊卵巢综合征慢性应激模型大鼠GCs 凋亡［26］；复方丹参滴丸通过调控IRE1-TRAF2-ASK1-JNK 通路降低ERS 保护血管平滑肌细胞。然而，中草药是否可以通过调节ERS 相关通路以抑制细胞凋亡进而改善卵巢储备功能，仍未有研究涉及，值得进一步验证探索。