神经丝蛋白轻链与癫痫相关研究进展*

王慧瑜 鹿树军 席娅琳 王美玲

癫痫是一种慢性严重的神经系统疾病，常反复发作。癫痫影响着所有年龄段的人群，并已成为影响全世界7 000 多万患者的全球健康问题，尤其是难治性癫痫，给患者及其家庭、社会均带来巨大负担。该疾病的发生是由于大脑活动异常导致，神经元网络之间的异常连接可能导致病理上的同步放电和随后的反复发作[1]。目前，尚无特定的生物标志物预测。

生物标志物是一种客观的检测方法，可以作为人体健康状况及观察疾病的进展和预后的指标。近年来，关于神经丝蛋白（neurofilaments，NF）作为神经系统疾病生物标志物的研究越来越多[2]。神经丝蛋白轻链（neurofilament light chain，NfL）是中枢神经系统轴突损害的标志物之一。越来越多的证据显示，脑脊液（CSF）和血液中的NfL 水平在多种神经系统退行性疾病中发生改变，并在疾病的发生发展中发挥作用，是一种潜在的辅助鉴别诊断和评估预后的生物标志物，但其与癫痫的关系还需要进一步探究[3-4]。因此，针对癫痫的早期诊断、治疗监测及预后评估的生物标志物研究仍是一个重大的临床挑战。

1 癫痫

1.1 癫痫的发生机制 癫痫是一种慢性神经系统疾病，它是由于神经元异常过度或同步化放电导致反复癫痫发作[5]。已确定的病因包括急性脑损伤（如神经营养不良、中风、脑肿瘤或癫痫持续状态）、基因突变、中枢神经系统感染、代谢紊乱和自身免疫状况[6]。癫痫发生是指将非癫痫性大脑转变为能产生自发、反复发作的大脑的过程。这一过程是由神经元网络内兴奋性和抑制性活动之间的不平衡造成的[7-8]，因此它可能以过度、超同步、振荡的方式发挥作用，一旦持续，就会干扰正常的神经元和神经元网络[9-10]。

1.2 癫痫致痫灶病理变化 颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）是成人最常见的癫痫类型，其中海马硬化（hippocampal sclerosis，HS）是最常见的病理改变。海马硬化的特点是海马角（cornu ammonis，CA）中CA1、CA3 和CA4 亚区的锥体细胞选择性死亡。齿状回颗粒细胞（granule cell，GC）的死亡程度远低于锥体细胞，但显示出两种不同的病理变化：其细胞体的迁移，称为颗粒细胞分散（granule cell dispersion，GCD），以及其轴突的发芽，即苔藓纤维发芽（mossy fiber sprouting，MFS）[11-13]。致痫性损伤后，会出现MFS 并形成新的突触连接。出芽的苔藓纤维（mossy fiber，MF）很可能与GC 的树突棘形成突触。GC 是齿状回中的神经元细胞，它们的棘状树突穿过颗粒细胞层投射到分子层，并在分子层中延伸和分出分支。苔藓细胞的丢失和MF 的发芽并不是简单用一个周期性兴奋网络取代另一个，相反，它用一个局部单突触的兴奋性反馈电路取代了一个远端分布的突触性兴奋性反馈电路[14-15]。有研究证明，在TLE 患者中，广泛的MFS 进入颗粒细胞层和分子层与CA4 和CA3区域的MF 缺失相关。MFS 取决于海马区选择性神经元丢失的程度。在轻度海马硬化伴轻度神经元死亡（Wyler 分级Ⅰ、Ⅱ级）的患者中，MF 通常沿其自然方式投射到CA4 和CA3 中，而很少有MF 发芽进入颗粒细胞层和分子层。相反，在严重的海马硬化症（Wyler Ⅲ、Ⅳ级）中，CA4 和CA3 区域中有大量的MF 发芽，这很可能是高度硬化症患者发芽的MF 和颗粒细胞丢失的代偿作用，并且与较长的癫痫病程有关。此外，MFS 与GCD 的程度也相关[12]。这些结果证实了MF 发芽的假设，即它们因海马神经元细胞死亡而失去了CA4 和CA3 区域的靶细胞。另外，相关研究显示，MFS 并不局限于齿状回，而且可能在没有靶神经元死亡的情况下发育。在大量TLE 患者中，HS 中的MFS 并不局限于颗粒细胞层和分子层，而是在CA2 区也有发现，在CA1 区的程度较低。以往认为，进入颗粒细胞层的经典的MFS 是由CA3和CA4 的靶神经元丧失引发的[12，16-17]。进入CA2 的MFS 可能被解释为类似的方式，因为CA2 和颗粒细胞层的神经元比CA4、CA3 和CA1 的神经元显示出更好的存活性。然而，除了发芽至CA2 的MF 外，CA1 区域也存在MFS，这是一个有明显细胞死亡的区域。该研究也表示，根据HS 的新ILAE 类型[18]，在ILAE 2 型中，尽管保留CA3 和CA4 的神经元细胞，但仍有广泛的MFS 进入颗粒细胞层、CA2 和CA1 区域。过去，TLE 中的MFS 被认为是由CA3和CA4 区域的靶神经元死亡触发的，并被定向到存活的颗粒细胞。而现有研究表明，MFS 到CA2 甚至CA1 区域，这与局部细胞损失无关[11]。

2 神经丝蛋白

2.1 神经丝蛋白的结构与功能 NF 是神经元细胞骨架的重要组成部分，主要分布于神经元的有髓轴突中，呈直的平行排列，且长度较长（平均118 mm），而分布在神经元树突和细胞核周中的NF 相对稀疏且弯曲[19-20]。根据NF 直径（约10 nm），将其归类为中间丝蛋白，介于肌动蛋白丝（6 nm）和肌球蛋白丝（15 nm）间。一个成熟神经系统中的NfL、神经丝中链（neurofilament medium chain，NfM）、神经丝重链（neurofilament heavy chain，NfH）、α-内联蛋白和外周蛋白组成。NF 由分子量不同的5 个亚基组成，它们在细胞骨架中具有结构功能，与其他纤维建立交叉桥接[21-22]。其中一个分子量较小的亚基——NfL 可作为轴突损伤的生物学标记物。神经元轴突损伤后，CSF 及在各种急性和慢性神经疾病的血液中NfL 均会随之升高，包括炎症、神经退行性疾病及中风。随着检测技术的发展，测量血液中NfL 水平已成为可能。因此，NfL 可能是未来临床实践和研究中最方便、最有希望的生物标志物之一[23-24]。

NF 通过与细胞骨架的其他成分交叉桥接和互连形成细胞骨架的组装和稳定性[25]。NF 通过维持轴突的大小、形状和口径来提供结构支持。此外，NF 构成了一个参与神经元分化、轴突生长和再生的动态网络。在大的有髓轴突中，高密度的NF 促进径向轴突生长。它们被认为对神经元轴突的径向生长和稳定性至关重要，从而实现有效的高速神经传导。在分子水平上，NF 有助于塑造细胞环境、定位细胞核并支持细胞器。一些报告表明，NF 可与其他蛋白质和细胞器相互作用，包括线粒体和微管[19-21]。NfL 是神经元轴突中肌球蛋白的主要配体之一[26]，NfL 与神经元轴突中的肌球蛋白Va（myosin Va，Myo Va）的N 端运动结构域结合，这对维持正常的Myo Va 水平、分布和运输至关重要。同时，Myo Va 与NfL 的结合还调节轴突中囊泡细胞器的分布[27-28]。NfL 与线粒体结合，并可能调节其动力学，如引起周围神经病变Charcot-Marie-Tooth 病的NfL 的基因突变会阻碍神经元线粒体的运动[29]。在编码NF 的基因中发现的几种突变可导致异常的神经丝聚集和积累，从而导致轴突功能障碍和神经退行性变。NfL 还参与细胞内信号传导、神经调节和转录。值得注意的是，最近的证据表明，NF 亚单位的独特组装体也是突触的组成部分。NfL 是突触棘的关键组成部分，对维持突触结构完整性和功能至关重要。NfL 对于维持N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）的稳定性和免疫突触的活性也至关重要[20，30]。

2.2 可溶性神经丝蛋白的检测 在NF 亚基中，NfL 是最丰富的，并且可溶于CSF 和血液。NfL 已成为许多神经系统急慢性疾病的重要生物标志物，如多发性硬化、阿尔茨海默病、帕金森病和急性脊髓损伤[31]。在过去三十年中，灵敏免疫分析技术的发展取得了很大的进展，NF 的检测技术逐步得到了改进，更具临床应用价值[21]。第一代免疫印迹法是半定量的检测方法，对血液中NfL 水平的检测灵敏度有限[32]。第二代酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）与第三代电化学发光免疫（electrochemiluminescence，ECL）两项检测技术虽可检测出不同疾病患者血液中的NF 水平，但尚不能监测与疾病相关的微小变化[33-34]。第四代单分子免疫阵列检测（single-molecule array，SiMoA），对于NfL 的定量，SiMoA 技术的灵敏度分别是ELISA 和ECL 检测的126 倍和25 倍。该技术提高了分析敏感度，从而可以在疾病和生理条件下观察到的浓度范围内可靠地量化血液中的NfL 水平。这种尖端方法基于单分子阵列和同时计数单个捕获微珠（直径2.7 μm），该微珠携带夹心抗体复合物（两种抗体和一种抗原）。分析敏感度比使用为CSF测量设计的ELISA 格式中使用相同抗体获得的敏感度高出许多倍，并且能可靠测量年轻健康个体血液样本中存在的低NfL 浓度[35]。因此可以监测正常老化或轻度损伤后发生的NfL 水平的变化。许多研究表明血清或血浆与中NfL 水平与CSF 中的水平呈正相关，证明了NfL 作为多种疾病的血液生物标志物的有效性[34，36]。因此允许从血液水平得出关于正在进行的神经轴突损伤程度的结论，而无需通过腰椎穿刺获得CSF[35，37-38]。在正常条件下，NfL 从轴突以恒定的低水平释放；然而，这个比率随着年龄的增长而增加。在轴突损伤时，脑脊液中NfL 的浓度可以增加到其原始水平的40 倍[37，39]。因此，NfL水平增加可以作为轴突损伤程度和疾病严重程度的指标[21]。

3 NfL与癫痫

在癫痫发生过程中，细胞变化包括神经退行性变、轴突出芽、轴突和髓鞘损伤、树突重塑、各种类型的胶质增生、炎性细胞侵袭、血脑屏障损伤、血管生成、细胞外基质成分的变化、物质（如铁和钙）的可能聚集[40]，这些病理变化形成了一个“细胞和分子生态系统”，在这个生态系统中，兴奋性增加，最终引发癫痫发作，并可通过治疗进行调节。致痫组织环境表达并分泌可作为不同癫痫适应证的生物标志物的分子，包括治疗试验，使用多种检测方法，如血液和CSF 分析、脑组织分析（如皮质或海马组织）、影像学或电生理学。重要的是，在每个阶段，致痫过程和生物标志物的发现都可能受到遗传组成、微生物群和暴露体的调节。在过去四年中，癫痫生物标志物研究的数量迅速增加[41]。轴突损伤的两个最成熟的脑脊液生物标志物是磷酸化微管相关蛋白tau 蛋白和NfL[42]。有研究指出，当神经轴突损伤时，NfL 可能大量释放到血液中[22]，因此代表了神经损伤的一个有前景的微创生物标志物。同时该研究也表明，癫痫持续状态患者的血清NfL（serum NfL，sNfL）水平明显高于耐药性癫痫患者组（单次孤立癫痫发作后24 h 内采集血样）和健康对照组，而耐药性癫痫患者组和健康对照组之间的sNfL 水平没有差异；且发现sNfL 和CSF NfL 水平之间存在高度相关性[22]。当分析sNfL 与治疗结果的关系时，难治性癫痫持续状态患者的sNfL 水平较高。以上结果支持只有重复癫痫发作活动才会导致神经元损伤的观点，可通过sNfL 水平来衡量。在癫痫持续状态中，血-脑屏障破坏可能导致脑脊液NfL 向血液的释放增加，使得sNfL 在这种情况下成为有效的神经轴索损伤的生物标志物。

4 展望

癫痫是神经病学面临的另一个重大挑战，需要对癫痫及其生物标志物进行积极探索。NfL 可能是未来关于癫痫，尤其是难治性癫痫，早期识别、诊断及治疗结果研究中最方便、最有希望的生物标志物之一。此外，作为神经系统变性疾病敏感的生物学指标之一，NfL 的临界值仍需进一步明确，且神经元受损后释放NfL 的具体过程目前尚未完全阐明，同时关于释放NfL 的具体始动因素、关键调控靶点的相关研究也相对较少。因此，未来仍需进一步明确NfL 在癫痫疾病中的具体作用及机制，为该疾病的早期诊断、治疗及新药物的研发提供依据。