雪梨止咳糖浆中11个成分的含量测定及化学计量学分析 Δ

庞茜茜 ，岳威冶 ，刘克勤 ，汤建华 （.河北北方学院附属第一医院药学部，河北 张家口 07506；.河北北方学院研究生学院，河北 张家口 07503）

雪梨止咳糖浆由梨清膏、苦杏仁、桔梗、枇杷叶、前胡、炙紫菀和款冬花组方而成，具有润肺、止咳、化痰的功效，临床上主要用于支气管炎、咳嗽、咳痰的治疗，尤其对小儿咳嗽变异性哮喘疗效显著，可有效改善患儿肺功能[1]。现有的雪梨止咳糖浆质量标准仅对方中白花前胡甲素进行了定量分析[2]，相关文献也仅限该方中单个成分的含量检测[3—5]，难以保证产品的整体质量及疗效稳定。

近年来，中药多指标定量控制结合化学计量学分析综合评价模式已广泛用于中药材及其制剂的质量评价中[6]。本研究依据雪梨止咳糖浆君、臣、佐、使配伍原则，结合各药味所含成分特点，选取方中枇杷叶特征成分蔷薇酸、委陵菜酸、马斯里酸和科罗索酸，苦杏仁特征成分苦杏仁苷，桔梗特征成分去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3，前胡特征成分白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡素E为检测指标，采用高效液相色谱（HPLC）法测定了该药中上述11个成分的含量，同时进行了化学计量学分析，旨在为该药的质量控制提供参考依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用的主要仪器有U3000型HPLC仪[赛默飞世尔科技（上海）有限公司]、1200型HPLC仪（美国Agilent公司）、BP210S型电子天平（德国Sartorius公司，d＝0.1 mg）、KQ3200DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

雪梨止咳糖浆（批号 200901、201205、201206、201221、201223、201224、210208、211019、211207、220113、220209、220301，编号S1～S12，规格为100 mL/瓶）购于葵花药业集团湖北武当有限公司。白花前胡甲素对照品（批号111711-201904，纯度99.4%）、白花前胡乙素对照品（批号111904-202105，纯度99.7%）和苦杏仁苷对照品（批号110820-202109，纯度93.1%）均购于中国食品药品检定研究院；委陵菜酸对照品（批号PRF22021441，纯度98.5%）、马斯里酸对照品（批号PRF9082922，纯度99.8%）和科罗索酸对照品（批号PRF8090101，纯度98.2%）均购于成都普瑞法科技开发有限公司；去芹糖桔梗皂苷E对照品（批号PS010234，纯度98.9%）和桔梗皂苷D3对照品（批号PS010235，纯度98.9%）均购于成都普思生物科技股份有限公司；桔梗皂苷E对照品（批号18030721，纯度98.5%）、蔷薇酸对照品（批号18052123，纯度98.8%）和白花前胡素E对照品（批号18031222，纯度99.9%）均购于上海同田生物技术股份有限公司。实验用乙腈和磷酸采用色谱纯级别，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 Ultimate AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温为30 ℃；流动相为0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～11 min，8.0%B；11～16 min，8.0%B→12.0%B；16～26 min，12.0%B→26.0%B；26～40 min，26.0%B→30.0%B；40～59 min，30.0%B→75.0%B；59～70 min，75.0%B→8.0%B）；流速为1.0 mL/min；检测波长分别为210 nm（0～40 min检测苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、蔷薇酸、委陵菜酸、马斯里酸和科罗索酸）[7—15]、321 nm（40～70 min检测白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡素E）[16—17]；进样量为10 µL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 取苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、蔷薇酸、委陵菜酸、马斯里酸、科罗索酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E对照品各适量，用60%甲醇稀释制成质量浓度依次为1.014、0.458、0.232、0.196、1.218、0.530、0.614、0.832、0.696、0.292、0.258 mg/mL的混合对照品母液，再将该母液用60%甲醇稀释20倍制得混合对照品溶液（11种对照品溶液质量浓度依次为50.7、22.9、11.6、9.8、60.9、26.5、30.7、41.6、34.8、14.6、12.9 μg/mL）。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取雪梨止咳糖浆10 mL，加60%甲醇10 mL，超声（功率150 W，频率40 kHz）处理5 min，放冷，以60%甲醇定容至25 mL，摇匀，过滤，即得。按雪梨止咳糖浆制备工艺[2]分别制备缺苦杏仁、缺桔梗、缺枇杷叶、缺前胡的阴性样品，再制备相应的阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液和供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图（图1）。结果显示，供试品溶液中11种成分的色谱峰与相邻色谱峰的分离度良好，色谱峰峰形尖锐；理论板数按白花前胡甲素峰计不低于6 500。

图1 各溶液的系统适用性试验HPLC图

2.4 多指标成分的定量检测

2.4.1 线性关系考察和灵敏度试验 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分别用60%甲醇稀释至20 mL，摇匀，制得系列混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图及峰面积。以各对照品的质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，以信噪比10∶1对应的质量浓度为定量限，以信噪比3∶1对应的质量浓度为检测限，结果见表1。

表1 苦杏仁苷等11种待测成分的线性关系考察和灵敏度试验结果

2.4.2 精密度试验 取同一混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样测定6次，记录色谱图及峰面积。结果显示，苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、蔷薇酸、委陵菜酸、马斯里酸、科罗索酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E峰面积的RSD依次为 1.23%、1.31%、1.40%、1.50%、1.52%、1.18%、1.34%、1.47%、1.03%、1.29%、1.37%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一份雪梨止咳糖浆（编号S1）制成的供试品溶液，于制备后0、2、4、7、12、18、24 h按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图及峰面积。结果显示，苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、蔷薇酸、委陵菜酸、马斯里酸、科罗索酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E峰面积的RSD依次为1.33%、1.40%、1.52%、1.57%、1.22%、1.37%、1.48%、1.01%、1.37%、1.28%、1.39%（n＝7），表明供试品溶液在制备后24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批雪梨止咳糖浆（编号S1）适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，记录色谱图及峰面积，以外标法计算11个待测成分的含量。结果显示，苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、蔷薇酸、委陵菜酸、马斯里酸、科罗索酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E含量的RSD依次为1.77%、1.85%、1.92%、1.94%、1.72%、1.80%、1.79%、1.67%、1.73%、1.79%、1.83%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取雪梨止咳糖浆（编号S1）9份，每份5.0 mL，每3份为1组，分别加入混合对照品溶液（11个对照品溶液的质量浓度分别为0.687、0.321、0.159、0.148、0.879、0.374、0.403、0.562、0.489、0.251、0.219 mg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，再按“2.2.2”项下方法制得加样供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图及峰面积，计算加样回收率。结果显示，苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、蔷薇酸、委陵菜酸、马斯里酸、科罗索酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E的平均加样回收率依次为98.80%、97.65%、97.44%、96.95%、100.01%、97.79%、98.35%、99.70%、98.64%、96.90%、99.34%，RSD依次为0.88%、1.32%、1.28%、1.40%、0.94%、1.55%、0.81%、0.67%、0.99%、1.07%、1.13%（n＝9）。

2.5 样品含量测定

取12批雪梨止咳糖浆，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图及峰面积，以外标法计算样品中苦杏仁苷等11个待测成分的含量，结果见表2。表2结果显示，11个待测成分的含量均有一定的批次间差异，尤其是苦杏仁苷、委陵菜酸、白花前胡素E、蔷薇酸、白花前胡甲素等成分的含量差异较为明显。

2.6 化学计量学分析

2.6.1 聚类分析 聚类分析（cluster analysis，CA）是通过分析事物的内在特点和规律，并根据相似性原则对事物进行分组的方法。将表2中含量数据导入SPSS 26.0软件，以欧氏距离为测度，采用组间连接法进行聚类分析，结果见图2。图2结果显示，12批雪梨止咳糖浆样品呈明显的分类趋势，当欧氏距离为15时，12批样品可聚为3类：样品S10～S12聚为一类，样品S7～S9聚为一类，样品S1～S6聚为一类。

图2 12批雪梨止咳糖浆样品的聚类树状图

表2 雪梨止咳糖浆中苦杏仁苷等11个待测成分的含量测定结果（n=3，mg/mL）

2.6.2 主成分分析 将表2中含量数据导入SPSS 26.0软件，以特征值与累计方差贡献率作为判定依据，计算主成分的特征值与方差贡献率，从而对主成分进行提取。以特征值＞1为提取标准，可得前2个主成分的特征值分别为7.452和2.286，方差贡献率分别为67.743%和20.786%，累计方差贡献率为88.53%，大于85%，可以反映雪梨止咳糖浆的综合质量，故选取前2个主成分进行评价。同时，应用SIMCA 14.1软件对表2中11个化学成分的含量数据建立主成分分析（principal component analysis，PCA）模型（图3），提取出2个主成分的R2X为0.885，大于0.5，表明所建立的模型稳定性较高。从图3可知，S1～S6、S7～S9、S10～S12分别各自呈现一定的关联性，这与CA结果相符。

图3 12批雪梨止咳糖浆样品的PCA模型得分图

2.6.3 偏最小二乘法-判别分析 以表2中含量数据为变量，运用SIMCA 14.1软件对12批雪梨止咳糖浆样品进行偏最小二乘法-判别分析（partial least squaresdiscrimination analysis，PLS-DA），得PLS-DA模型（图4）。结果显示，模型拟合度R2Y为0.929，预测能力Q2为0.866，二者均大于0.5，表明模型拟合较好、稳定可靠、预测能力强。对建立的PLS-DA 模型进行200次置换检验，结果显示R2拟合直线在Y轴上的截距为0.097，小于0.3，表明所建立的PLS-DA模型结果可靠；Q2拟合直线在Y轴上的截距为-0.284，表明所构建的PLS-DA模型不存在过度拟合，可有效判别分析12批雪梨止咳糖浆样品的质量差异。变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）分析结果显示，11个待测成分对雪梨止咳糖浆质量的影响程度由大到小依次为：蔷薇酸＞苦杏仁苷＞白花前胡甲素＞委陵菜酸＞科罗索酸＞去芹糖桔梗皂苷E＞马斯里酸＞白花前胡乙素＞白花前胡素E＞桔梗皂苷E＞桔梗皂苷D3，其中蔷薇酸（VIP＝1.986）、苦杏仁苷（VIP＝1.334）和白花前胡甲素（VIP＝1.115）是影响雪梨止咳糖浆质量的差异标志物（VIP＞1）。

图4 12批雪梨止咳糖浆样品的PLS-DA模型得分图

3 讨论

3.1 含量测定成分的选择

雪梨止咳糖浆由梨清膏、枇杷叶、炙紫菀、款冬花、苦杏仁、桔梗和前胡加工而成，方中梨清膏生津润燥、清热化痰，为君药；枇杷叶清肺化痰、降气止咳，炙紫菀和款冬花润肺化痰止咳，共为臣药；苦杏仁降气止咳，桔梗宣肺祛痰止咳，前胡宣肺止咳，共为佐药。诸药合用，共奏润肺止咳化痰之功[18]。梨清膏由蔷薇科植物白梨和秋子梨等栽培品种果实加工而成，笔者在预实验过程中曾尝试对梨清膏所含成分进行定量研究，但因梨的品种来源存在差异，且所含成分含量较低，难以对其准确定量；同时，考虑到款冬花、紫菀主要含槲皮素、山柰酚等黄酮类成分，方中多味药物均含有该类成分，成分专属性不强，综合考虑最终选取臣药枇杷叶的特征成分蔷薇酸、委陵菜酸、马斯里酸和科罗索酸，佐药苦杏仁特征成分苦杏仁苷，桔梗特征成分去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E和桔梗皂苷D3，前胡特征成分白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡素E为含量测定的目标成分。

3.2 检测波长的选择

笔者参考相关文献及各对照品的紫外全波长（190～400 nm）扫描图谱，比较了207 nm[7]、210 nm[8—15]、321 nm[16—17]波长下供试品溶液的色谱曲线，发现采用210 nm检测苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、蔷薇酸、委陵菜酸、马斯里酸、科罗索酸，采用321 nm检测白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡素E时，色谱峰基线较平稳，11个待测成分与相邻色谱峰均能完全分离，且响应值最大，故选其作为检测波长。

3.3 样品含量测定与化学计量学分析结果评价

从12批雪梨止咳糖浆样品中11个待测成分的含量测定结果来看，各成分含量均存在一定的批间差异，这可能与制剂生产原药材种属、产地等差异有关；CA、PCA结果显示，12批样品可分为3类，即S1～S6、S7～S9、S10～S12各为一类，也证实了这一点，提示药企应稳定原药材来源，提升原药材内控质量标准，使制剂质量更加稳定。PLS-DA结果显示，蔷薇酸、苦杏仁苷和白花前胡甲素对制剂质量贡献度较大，是影响雪梨止咳糖浆质量的差异标志物，提示药企应关注制剂中上述成分尤其是蔷薇酸、苦杏仁苷和白花前胡甲素的含量，建立其质量控制体系，以提高制剂质量的稳定性与一致性，从而确保临床疗效。

综上所述，本研究采用HPLC法对雪梨止咳糖浆中苦杏仁苷、去芹糖桔梗皂苷E、桔梗皂苷E、桔梗皂苷D3、蔷薇酸、委陵菜酸、马斯里酸、科罗索酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素和白花前胡素E的含量同时进行了检测，建立了雪梨止咳糖浆多指标成分定量控制方法，同时联合化学计量学方法对含量检测数据进行了综合评价，挖掘出了影响雪梨止咳糖浆质量的差异标志物，可为该制剂的质量控制提供参考依据。