基于熵权TOPSIS法综合评价不同产地枇杷叶质量 Δ

高伟城 ，王小平 ，肖晓琳 ，施义炜 ，林少芬 （.漳州卫生职业学院药学系，福建 漳州 6000；.福建省漳州市医院药学部，福建 漳州 6000；.漳州市聚善堂药业有限公司，福建 漳州 6000）

枇杷叶是一味临床常用中药，主要分布于安徽、江苏、江西、贵州等地[1]。不同产地的环境因素会影响枇杷叶的质量，故建立完善的枇杷叶质量评价标准，有利于保证枇杷叶质量的稳定性和疗效的一致性。关于枇杷叶的质量评价，《雷公炮炙论》《本草备要》等均记载以重量大者为佳[2]。但目前有关枇杷叶片重与其品质相关性的研究尚未见报道。2020年版《中国药典》（一部）以醇溶性浸出物及齐墩果酸、熊果酸的含量作为枇杷叶的质量评价依据[3]。然而，有研究表明，科罗索酸、山楂酸和熊果酸等三萜酸类成分也是枇杷叶的主要药效成分，具有抗炎、止咳以及降血糖等作用[4—5]；同时，也有研究表明，枇杷叶中黄酮类成分具有增强免疫力、降血脂、抗氧化等功效[6]。中药具有多成分协同作用的特点，采用多指标对其进行综合评价更为科学合理。熵权逼近理想排序法（technique for order preference by similarity to an ideal solution，TOPSIS）可减少主观因素影响，评价更为客观、全面，现已被广泛应用于中药质量评价中[7]。因此，本研究以醇浸出物、总黄酮、总三萜酸和5个代表性三萜酸类成分（野鸦椿酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸）的含量为评价指标，采用熵权TOPSIS法对不同产地枇杷叶的品质进行综合评价，并将枇杷叶片重与综合评价值、各评价指标进行双变量相关性分析，以期为枇杷叶的质量控制及临床应用提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用的主要仪器有1260型高效液相色谱（HPLC）仪（美国Agilent公司），TU-1901型双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），Mettler-Toledo XSE 205DU型电子分析天平（瑞士Switzerland公司），OHAUS PX224ZH/E型电子分析天平[奥豪斯仪器（常州）有限公司]，KQ5200型超声波清洗器 （昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

笔者于2021年4-9月从福建、广东、浙江、江苏等地采收枇杷叶药材样品共30份，经漳州卫生职业学院中药教研室王小平教授鉴定为蔷薇科植物枇杷Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的叶。新鲜枇杷叶用沸水烫3 min，取出晾干，再用鼓风干燥箱于70 ℃条件下烘干4 h，备用；每份分别取片形接近的干品枇杷叶10片称定重量，得到每份样品的平均片重。通过“指南针”APP获取采样点的海拔、经纬度信息，详见表1。

表1 枇杷叶药材样品信息

对照品野鸦椿酸（批号MUST-21011201，纯度98.73%）、山楂酸（批号MUST-20062813，纯度99.79%）、科罗索酸（批号MUST-20061305，纯度99.79%）、齐墩果酸（批号MUST-19032706，纯度98.33%）、熊果酸（批号MUST-19062710，纯度 98.46%）、芦丁（批号 MUST-21011510，纯度99.51%）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；HPLC用甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为自制纯化水。

2 方法与结果

2.1 醇溶性浸出物的含量测定

以75%乙醇为溶剂，根据2020年版《中国药典》（四部）通则“2201浸出物测定法”中热浸法测定枇杷叶中醇溶性浸出物的含量[8]。每个样品平行测定3次。结果显示，不同产地枇杷叶样品中醇溶性浸出物的含量范围为（24.56±0.08）%～（34.85±0.13）%，均符合2020年版《中国药典》（一部）规定的不得少于18%的要求[3]。其中，样品S28中醇溶性浸出物的含量最高，样品S18中醇溶性浸出物的含量最低。结果见表2。

表2 不同产地枇杷叶样品中醇溶性浸出物、总黄酮及总三萜酸的含量测定结果（±s，n=3）

表2 不同产地枇杷叶样品中醇溶性浸出物、总黄酮及总三萜酸的含量测定结果（±s，n=3）

编号S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15醇溶性浸出物/%26.25±0.60 27.76±0.40 28.20±0.23 27.35±0.15 29.25±0.13 31.79±0.19 28.55±0.22 28.44±0.52 29.10±0.32 25.23±0.14 31.91±0.30 25.41±0.06 26.87±0.38 32.90±0.63 25.98±0.15总黄酮/（mg/g）9.04±0.17 10.21±0.28 11.65±0.29 5.56±0.12 10.85±0.31 11.60±0.24 9.02±0.26 10.38±0.16 10.88±0.08 7.73±0.17 10.31±0.15 9.11±0.21 6.89±0.19 11.04±0.18 6.21±0.10总三萜酸/（mg/g）57.99±1.09 38.83±0.48 38.66±0.92 47.92±0.82 31.82±0.64 42.88±1.03 41.52±0.62 47.29±0.49 45.92±0.48 42.26±0.74 39.19±0.25 55.73±0.88 41.93±0.60 63.95±1.27 44.19±0.59编号S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30醇溶性浸出物/%29.97±0.18 26.82±0.23 24.56±0.08 30.18±0.10 30.62±0.30 28.29±0.13 28.29±0.32 29.87±0.12 29.50±0.43 24.58±0.37 28.62±0.20 27.84±0.37 34.85±0.13 29.25±0.23 28.72±0.53总黄酮/（mg/g）14.23±0.27 10.45±0.19 6.58±0.10 9.63±0.18 10.81±0.06 9.66±0.09 6.67±0.11 8.06±0.24 12.06±0.11 4.69±0.11 10.26±0.12 11.53±0.33 9.88±0.19 10.42±0.16 12.54±0.27总三萜酸/（mg/g）34.50±0.71 27.58±0.59 40.96±0.56 41.28±0.98 39.20±0.88 47.40±0.97 46.15±1.30 58.70±1.67 42.06±0.81 41.54±1.16 45.92±0.92 45.03±0.97 36.47±0.51 49.10±0.96 41.46±0.77

2.2 总黄酮的含量测定

采用紫外分光光度法（检测波长为510 nm，显色剂为亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠）测定枇杷叶中总黄酮的含量。

2.2.1 芦丁对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品适量，置于25 mL容量瓶中，加50%乙醇超声（功率250 W，频率50 kHz，下同）溶解并定容，摇匀，即得质量浓度为21.2 μg/mL的芦丁对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取干燥枇杷叶粗粉约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，称定质量，浸泡30 min后，加热回流提取1 h，放冷，再次称定质量，加50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，备用。

2.2.3 方法学考察 按文献[9]方法操作进行方法学考察。以吸光度（A）为纵坐标、芦丁质量浓度（c）为横坐标绘制标准曲线后，得线性回归方程为A＝0.138 8c-0.006 4（r＝0.999 2），芦丁的线性范围为 2.12～6.36 μg/mL。精密度、重复性、稳定性（24 h）试验结果的RSD分别为1.63%、2.41%、2.57%（n＝6）；加样回收率结果显示，芦丁的平均加样回收率为98.28%（RSD＝2.47%，n＝6）。

2.2.4 样品测定 精密吸取0.2 mL不同产地枇杷叶的供试品溶液，采用紫外分光光度法进行测定，计算样品中总黄酮含量。每个样品平行测定3次。结果表明，不同产地枇杷叶中总黄酮的含量差异较大。其中，样品S16中总黄酮的含量最高，样品S25中总黄酮的含量最低。结果见表2。

2.3 总三萜酸的含量测定

采用紫外分光光度法（检测波长为550 nm，显色剂为香草醛-冰醋酸-高氯酸）测定枇杷叶中总三萜酸的含量。

2.3.1 熊果酸对照品溶液的制备 精密称取熊果酸对照品12.50 mg，置于100 mL容量瓶中，加95%乙醇超声溶解并定容，摇匀，即得质量浓度为125 μg/mL的熊果酸对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品粗粉约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再次称定质量，加95%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1 mL，用95%乙醇定容于25 mL容量瓶中，备用。

2.3.3 方法学考察 按文献[10]方法操作进行方法学考察。以吸光度（A）为纵坐标、熊果酸质量浓度（c，μg/mL）为横坐标绘制标准曲线后，得到线性回归方程为A＝0.032 7c-0.000 6（r＝0.999 2），熊果酸的线性范围为4.17～20.83 μg/mL。精密度、重复性及稳定性（24 h）试验结果的RSD分别为1.28%、2.01%、2.33%（n＝6）；加样回收率试验结果显示，熊果酸的平均加样回收率为98.28%（RSD＝2.14%，n＝6）。

2.3.4 样品测定 精密吸取1 mL不同产地枇杷叶的供试品溶液，采用紫外分光光度法进行测定，计算样品中总三萜酸含量。每个样品平行测定3次。结果显示，不同产地枇杷叶总三萜酸的含量差异明显。其中，样品S14中总三萜酸的含量最高，S17中总三萜酸的含量最低。结果见表2。

2.4 5个三萜酸类成分的含量测定

采用HPLC法测定枇杷叶样品中5个三萜酸类成分的含量。

2.4.1 溶液的制备 （1）混合对照品溶液的制备：分别精密称取野鸦椿酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸及熊果酸对照品各适量，置于同一25 mL容量瓶中，加95%乙醇超声溶解并定容至刻度，制成每1 mL分别含594、580、808、302.5、1217.5 μg上述成分的混合对照品溶液，备用。（2）供试品溶液的制备：分别取不同产地枇杷叶样品粗粉各约2 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇25 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再次称定质量，加95%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm微孔滤膜，收集滤液，备用。

2.4.2 色谱条件与系统适用性试验 采用Shim-pack Scepter HD-C18-80（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈（A）-甲醇（B）-0.5%乙酸铵溶液（C）为流动相进行梯度洗脱（0～20 min：3%A→15%A，76%B→64%B，21%C；20～50 min：15%A→20%A，64%B→59%B，21%C）；流速为1.0 mL/min；柱温为40 ℃；检测波长为210 nm；进样量为20 μL。取“2.4.1”项下溶液及空白溶剂（95%乙醇）按此色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，5个三萜酸类成分与其相邻峰间的分离度均大于1.5，理论板数按熊果酸计大于5 000，且空白溶剂对各成分的测定无干扰。结果见图1。

图1 系统适用性试验HPLC图

2.4.3 方法学考察 按文献[11]方法操作进行方法学考察。以进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归获取回归方程；采用95%乙醇逐级稀释混合对照品溶液并进样分析，当信噪比为3∶1、10∶1时分别得检测限和定量限。结果显示，野鸦椿酸的回归方程为Y＝471.76X-37.818（r＝0.999 9），线性范围为 1.485～11.880 μg，检测限为1.537 ng，定量限为5.126 ng；山楂酸的回归方程为Y＝ 464.63X-50.207（r＝0.999 9），线性范围为1.450～11.600 μg，检测限为2.625 ng，定量限为8.750 ng；科罗索酸的回归方程为Y＝ 397.8X+13.565（r＝0.999 9），线性范围为 2.020～26.160 μg，检测限为3.189 ng，定量限为10.631 ng；齐墩果酸的回归方程为Y＝408.59X-51.659（r＝0.999 7），线性范围为 0.756～6.050 μg，检测限为5.642 ng，定量限为18.807 ng；熊果酸的回归方程为Y＝417.29X+5.614 2（r＝0.999 9），线性范围为3.044～22.350 μg，检测限为5.599 ng，定量限为18.663 ng。精密度、重复性及稳定性（24 h）试验结果良好（RSD均小于2%，n＝6）。野鸦椿酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸的平均加样回收率分别为98.51%、99.32%、99.01%、98.21%和101.02%（RSD均小于2.5%，n＝6）。

2.4.4 样品测定 分别取不同产地枇杷叶样品适量，按“2.4.1（2）”项下方法制备供试品溶液，每个样品平行制备3份。将上述90份供试品溶液分别按“2.4.2”项下色谱条件测定，并根据“2.4.3”项下回归方程计算含量。结果显示，不同产地枇杷叶中5个三萜酸类成分的含量有明显差异。其中，样品S14中野鸦椿酸、山楂酸和科罗索酸的含量最高，样品S19中齐墩果酸和熊果酸的含量最高；样品S4中野鸦椿酸、山楂酸含量最低，样品S7中科罗索酸含量最低，样品S1中齐墩果酸含量最低，样品S3中熊果酸含量最低。并且，有7个产地的枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的总含量低于2020年版《中国药典》（一部）要求（即含齐墩果酸和熊果酸的总含量不少于0.7%）[3]，分 别 是 S2～S4、S7、S10、S16、S17。结果见表3。

表3 不同产地枇杷叶样品中5个三萜酸类成分的含量测定结果（±s，n=3，mg/g）

表3 不同产地枇杷叶样品中5个三萜酸类成分的含量测定结果（±s，n=3，mg/g）

编号S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15野鸦椿酸2.164±0.041 1.161±0.020 2.013±0.052 0.728±0.011 2.770±0.042 1.621±0.023 1.767±0.022 2.364±0.021 2.666±0.053 1.457±0.020 2.193±0.031 4.156±0.042 2.358±0.041 6.064±0.063 1.499±0.042山楂酸1.258±0.024 0.557±0.011 1.045±0.020 0.526±0.013 1.809±0.026 1.098±0.023 0.789±0.013 1.142±0.025 1.032±0.014 0.828±0.021 1.268±0.020 2.456±0.033 1.511±0.021 3.245±0.022 1.186±0.024科罗索酸3.551±0.072 1.583±0.031 1.896±0.043 2.157±0.054 3.013±0.061 2.051±0.033 1.222±0.025 3.331±0.023 2.377±0.065 2.031±0.031 2.476±0.064 3.015±0.053 3.708±0.096 8.807±0.094 3.402±0.075齐墩果酸0.856±0.021 1.191±0.023 1.325±0.034 1.162±0.031 2.237±0.032 1.879±0.042 1.273±0.022 1.418±0.033 1.712±0.021 1.107±0.024 1.503±0.045 2.068±0.072 1.336±0.011 2.313±0.042 1.639±0.021熊果酸6.825±0.112 5.674±0.104 4.074±0.087 4.848±0.092 8.738±0.173 7.029±0.061 4.793±0.072 5.651±0.084 7.188±0.163 4.952±0.074 5.963±0.053 7.389±0.112 5.916±0.133 9.436±0.094 6.520±0.121编号S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30野鸦椿酸1.194±0.020 1.651±0.031 1.832±0.041 4.211±0.094 2.317±0.053 1.941±0.042 1.210±0.011 2.323±0.052 1.493±0.051 2.358±0.064 1.361±0.022 2.102±0.053 1.936±0.041 3.061±0.052 3.587±0.073山楂酸0.805±0.012 0.834±0.021 1.199±0.023 2.580±0.072 1.349±0.021 1.215±0.022 0.860±0.011 1.547±0.031 1.159±0.032 1.151±0.044 0.956±0.022 0.975±0.024 0.967±0.021 1.855±0.033 1.518±0.031科罗索酸1.942±0.041 1.737±0.030 3.482±0.084 6.373±0.121 3.775±0.032 2.923±0.041 2.219±0.022 6.546±0.111 3.185±0.110 3.708±0.073 2.448±0.031 1.926±0.050 4.154±0.091 3.757±0.032 1.943±0.051齐墩果酸1.158±0.021 1.240±0.020 1.184±0.030 2.931±0.075 1.812±0.211 2.225±0.042 1.560±0.031 1.680±0.033 1.874±0.031 1.336±0.032 1.784±0.030 1.788±0.041 1.538±0.034 2.468±0.052 1.667±0.032熊果酸5.184±0.112 5.169±0.101 7.500±0.150 11.806±0.283 7.514±0.101 9.769±0.252 6.307±0.051 6.608±0.112 8.723±0.113 5.916±0.124 7.604±0.202 6.667±0.153 5.723±0.111 10.246±0.183 6.625±0.122

2.5 熵权TOPSIS法分析

将齐墩果酸和熊果酸总含量符合2020年版《中国药典》（一部）要求的23个样品作为分析样本，采用熵权TOPSIS法对样品中8个指标（醇溶性浸出物、总黄酮、总三萜酸以及5个代表性三萜酸单体成分）的数据进行归一标准化处理，并采用熵值法计算权重，得到醇溶性浸出物、总黄酮、总三萜酸、野鸦椿酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸的权重依次为0.126、0.114、0.105、0.122、0.146、0.137、0.092、0.157。将熵值标准化处理后的数据进行向量规范化处理，得到加权决策矩阵，计算不同产地枇杷叶样品到正向理想解和负向理想解的距离（分别记为和），最终进行相对接近度（ci）分析。ci越接近1，表示样品的综合评价越好[7]。结果表明，不同产地枇杷叶品质的综合评价值（即ci）排名前3位的依次为样品S14、S19和S29。结果见表4。

表4 不同产地枇杷叶样品的熵权TOPSIS法分析结果

2.6 双变量相关性分析

将符合2020年版《中国药典》（一部）要求的23份枇杷叶的8个质量评价指标的结果、平均片重、综合评价值（即ci）的数据导入SPSS 22.0软件，运用Pearson相关分析方法进行双变量相关性分析。结果显示，醇溶性浸出物含量与总黄酮含量呈正相关（P＜0.01）；总三萜酸含量与野鸦椿酸、山楂酸、科罗索酸及综合评价值呈正相关（P＜0.05）；野鸦椿酸与山楂酸、科罗索酸、平均片重及综合评价值呈正相关（P＜0.01），同时与齐墩果酸、熊果酸含量呈正相关（P＜0.05）；山楂酸含量与科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸含量和平均片重、综合评价值呈正相关（P＜0.01）；科罗索酸含量与平均片重、综合评价值呈正相关（P＜0.01）；齐墩果酸含量与熊果酸含量和综合评价值呈正相关（P＜0.01）；平均片重与综合评价值呈正相关（P＜0.01）。结果见表5。

表5 不同产地枇杷叶样品质量评价指标的相关性分析结果（r值）

3 讨论

3.1 不同产地枇杷叶样品指标性成分含量变化分析

各指标含量测定结果显示，不同产地枇杷叶中总黄酮、总三萜酸及5个代表性三萜酸类成分的含量均有较大差异（最大值是最小值的2～9倍），其中以野鸦椿酸、山楂酸及科罗索酸这3个三萜酸类成分的含量差异最为显著（最大值是最小值的6～9倍）。此外，本研究从广东采集了4个地区枇杷叶样品，结果有3个采集地的枇杷叶样品中齐墩果酸和熊果酸的总含量低于2020年版《中国药典》（一部）要求的0.7%。但据《现代中药材商品通鉴》记载：“枇杷叶江苏产量大，广东质量佳”[12]；《金世元中药材传统鉴别经验》也记载：“广东、福建产者叶片大，而且叶厚，茸毛少，称为广杷叶，质优”[13]。本研究结果与上述记载不太相符，这可能与样品采集地的环境气候因子（如光照、温湿度等）有关。

3.2 枇杷叶质量控制分析

熵权TOPSIS法分析结果显示，综合评价值排名前3位的样品依次为S14（福建漳州云霄县火田镇产）、S19（广西钦州钦南区产）及S29（安徽亳州涡阳县产）。相关性分析结果表明，枇杷叶的平均片重与综合评价值呈正相关（P＜0.01），这与传统认为重量大者为佳的观点一致[2]。并且，本研究结果还显示，枇杷叶的综合评价值与野鸦椿酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸这5个三萜酸类成分的含量均呈正相关（P＜0.01），而2020年版《中国药典》（一部）仅收载了醇溶性浸出物以及齐墩果酸、熊果酸的含量作为枇杷叶的质量评价依据。因此，笔者建议将野鸦椿酸、山楂酸及科罗索酸含量也纳为枇杷叶的评价指标，进一步完善和提高枇杷叶的质量评价标准。

综上所述，本研究以醇溶性浸出物、总黄酮、总三萜酸以及5个代表性三萜酸单体成分含量为评价指标，采用熵权TOPSIS法对不同产地枇杷叶质量进行了综合评价，发现不同产地枇杷叶的质量存在显著性差异，其中以福建漳州云霄县火田镇产、广西钦州钦南区产和安徽亳州涡阳县产枇杷叶的综合评价值排名相对靠前，可为优选枇杷叶的产地提供依据。同时，本研究也证实，枇杷叶片重与其品质呈正相关，但枇杷叶片重具体多大为佳有待进一步深入研究。