贺兰山东麓‘蛇龙珠’葡萄病毒病种类鉴定及对采收期的影响

张强强，顾沛雯，张继丰

(1.宁夏大学 农学院，银川 750021；2.宁夏西鸽酒庄有限公司，宁夏青铜峡 751100)

‘蛇龙珠’葡萄(Cabernet gernischt)是‘品丽珠’‘赤霞珠’等品种混合群体中，经过长期选育而成的一个酿酒葡萄品种[1]。其酿造的葡萄酒常带有独特的草本气息，单宁质地柔软，入口顺滑，成为国内独具代表性的红色酿酒葡萄之一。该品种耐干旱，喜沙壤土质，在宁夏贺兰山东麓和甘肃河西走廊种植表现良好，是宁夏主栽的红色酿酒葡萄品种之一[2]。但是随着宁夏葡萄种植面积的扩大，葡萄苗木引进和输出日益频繁，造成葡萄病毒病危害猖獗，研究发现贺兰山东麓主要葡萄病毒病为卷叶病和扇叶病，‘蛇龙珠’感染病毒率最高，为85.1%[3-4]。

葡萄病毒种类繁多，迄今为止，从世界各地的葡萄上分离的病毒有86种[5]，国内报道有18种[6-14]，其中对卷叶伴随病毒(Grapevine leafrool-associated virus，GLRaV)和葡萄扇叶病毒( Grapevine fanleaf virus，GFLV)研究最多。常用葡萄病毒的鉴定方法主要有指示植物鉴定法、酶联免疫吸附测定法、逆转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)检测技术、分子杂交检测方法、逆转录环介导恒温扩增检测技术和小RNA测序技术，目前我国己报道的葡萄病毒多采用RT-PCR方法确定[15]。吕苗苗等[4]利用5种葡萄卷叶伴随病毒引物对宁夏贺兰山东麓‘蛇龙珠’葡萄进行RT-PCR检测，初步检出3种卷叶病毒类型，其中GLRaV-3的检出率最高，为87.5%；刘万好等[16]通过小RNA测序鉴定出山东烟台地区叶片反卷的‘蛇龙珠’携带有7种已知病毒和4种类病毒。‘蛇龙珠’葡萄复合侵染严重，但对感染病毒种类与症状类型的关系相关报道较少。

葡萄感染病毒后，会对葡萄的产量、生理机能和品质产生重大影响[5]。Andret-link等[17]发现葡萄扇叶病可导致植株节间缩短，显著降低产量，症状严重时，损失可达80%以上。Endeshaw等[18]研究认为‘品丽珠’感染GLRaV-3后，降低了每藤新梢数、新梢生长和木质化程度。韩爱芹等[19]发现，感染卷叶病后葡萄果实的葡萄糖和果糖的总量仅为对照组的69.29%，5种花色苷单体含量显著降低，总量仅为对照组总量的26.12%。目前有关葡萄病毒病的研究表明，病毒病会降低葡萄叶片中叶绿素含量及光合速率，减少总糖含量，提高酸度[16,19]。鉴于国内有关病毒病对‘蛇龙珠’葡萄品质和采收期的影响的研究较少。本研究以贺兰山东麓树龄超过20a的‘蛇龙珠’葡萄为材料，利用RT-PCR进行15种葡萄病毒的检测，明确‘蛇龙珠’葡萄感染病毒的种类及造成危害的主要病毒，在此基础上，通过测定罹病和无症状对照组‘蛇龙珠’葡萄的光合指标和果实理化指标，运用主成分分析法，评价不同采收时间对罹病和对照组‘蛇龙珠’葡萄果实成熟度、葡萄品质及采收期的影响，以期为该产区葡萄无毒化种植提供依据，也为准确把握‘蛇龙珠’葡萄最佳采收期提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

2020 年8月于宁夏西鸽酒庄葡萄园中，从感染病毒病和外观正常的‘蛇龙珠’葡萄树上采集叶片和果实，罹病葡萄选取标准：叶片反卷、发红，出现扇叶化症状；无症状对照组葡萄选取标准：葡萄植株正常，叶片无卷叶、发红、扇叶化症状，生长期保持绿色平整状态。

1.2 方 法

1.2.1 采样 在‘蛇龙珠’葡萄完成转色后(2020年8月15日)进行采样，每次采样分别选取5棵罹病和对照组葡萄树，每棵树按上、中、下部位随机采集3穗葡萄和3片葡萄叶，共采样5次，采样日期分别为8月15日、8月28日、9月8日、9月20日和9月27日。以同一树体的3片葡萄叶为1个样品，用锡箔纸包好后迅速放入液氮罐中，罹病和对照组各25份样品，存于-80 ℃冰箱备用，用于葡萄病毒检测；采集的葡萄果穗放入冰盒带回实验室，取一部分鲜样用4 层纱布挤汁待用，用于还原糖、滴定酸、pH和可溶性固形物的测定；将剩余样品经液氮迅速冷冻，使用研磨打样机(SL-200)将果实样品粉碎，-80 ℃冰箱贮存备用，用于总酚、单宁和花青素的测定。

1.2.2 RT-PCR检测 根据文献[4,14]设计15种葡萄病毒病的特异性引物，引物序列见表1。

将采集的葡萄叶片加入液氮迅速研磨至粉末状，取100 mg至1.5 mL的离心管中，按照OMEGA 植物RNA提取试剂盒(美国OMEGA公司)使用说明书进行总RNA的提取。提取出的总RNA采用反转录试剂盒(北京全式金生物有限公司)说明书反转录成cDNA，采用设计的特异性引物对样品中病毒进行检测，每个样品重复3次。

PCR扩增反应体系50 μL：cDNA 2 μL，正向、反向引物各2 μL，MaxTaq酶25 μL，RNase-free Water 18 μL；PCR扩增条件：94 ℃ 3 min， 94 ℃ 1 min，退火45 s，退火温度见表1，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃ 10 min。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测产物。PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

表1 用于RT-PCR检测的15种葡萄病毒引物Table 1 Primers of 15 grapevine viruses for RT-PCR detection

1.2.3 测定项目及方法 采用叶绿素计(SPAD-502型)测定SPAD值；采用便携式光合仪(GFS-3000型，德国)测定净光合速率、蒸腾速率、叶片气孔导度、胞间二氧化碳浓度；采用斐林试剂滴定法(GB/T 15038-2006)测定还原糖；采用酸碱滴定法(GB/T 15038-2006)测定滴定酸(以酒石酸计)；采用pH 计(PHS-3C，上海)测定葡萄汁pH；采用手持糖度计(ATAGOPAL-1，上海)测定其可溶性固形物含量；采用Folin-Denis(福林丹尼斯)试剂显色法[20]测定单宁含量；采用Folin-Ciocalteu(福林酚)试剂显色法[21]测定总酚；采用pH 示差法[22]测定总花青素；采用称量法测定百粒质量，每个样品测定3次。

1.2.4 统计分析样本间差异 采用Microsoft Excel 2010对数据进行整理，采用SPSS 21.0邓肯氏多重比较进行显著性分析，采用Origin 2018进行主成分分析及制图，得出主成分函数方程式，计算不同采收时期综合得分，确定最佳采收期。

2 结果与分析

2.1 ‘蛇龙珠’葡萄病毒病田间发病症状

如图1所示，‘蛇龙珠’葡萄植株感染病毒病后，绝大多数表现为卷叶症状。感染病毒初期，叶片轻微向后翻卷，叶脉黄绿色，叶片保持绿色(图1-a)；之后叶片逐渐出现红色或紫红斑点(图1-b)；随着叶片生长，红色斑点逐渐变大成为紫红色不规则肉斑(图1-c)，直至整个叶片变紫红，透过阳光看呈鲜红色，叶脉黄绿色，叶片反卷(图1-d)，后期葡萄中部和底部叶片反卷变红，变厚变脆(图1-e)。

在田间‘蛇龙珠’葡萄感染病毒后期表现4种症状，Ⅰ型：叶片反卷，叶缘锐呈不规则锯齿状，叶肉紫红色(图1-f)；Ⅱ型：叶片发红，叶脉黄色，叶片反卷明显，叶脉间有黑色斑块(图1-g)；Ⅲ型：叶片未发生反卷，叶脉黄绿色，叶脉间有红色斑块(图1-h)；Ⅳ型：叶片反卷，叶脉为黄绿色，正反看叶脉间都有紫黑色肉斑(图1-i)。

图1 ‘蛇龙珠’葡萄病毒病田间症状Fig.1 Field symptoms of virus disease in ‘Cabernet Gernischt’ grape

此外，前期在‘蛇龙珠’叶片上还发现两种类似扇叶病症状，如图2所示。一种为扇形叶或畸形叶：叶片皱缩畸形，叶缘缺刻深，缺口深达主脉，叶脉不对称、扭曲、明脉，叶缘锯齿锐呈不规则状，叶柄洼开角大，主脉聚近，呈扇叶状(图2-a)。另一种为花叶形：叶片上分布有许多边缘不清、形状不规则的黄色斑点或斑块，颜色浓淡不同，呈环状线纹、褪绿环状圆或不规则形(图2-b)。

a.扇形叶症状; b.花叶形症状a. Symptoms of grapevine fan leaf type; b. Symptoms of grapevine mosaic type

2.2 ‘蛇龙珠’葡萄病毒种类鉴定

利用15种病毒引物，对采集的罹病和对照组共50份田间样品进行RT-PCR检测，并对扩增产物进行凝胶电泳和测序分析，结果如表2和图3所示，罹病样品均检测到病毒，共有8种葡萄病毒，分别是GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GFLV、GRSPaV、GVA、GPGV和GINV；对照组样品检测到3种病毒，分别是GRSPaV、GVA和GINV，其中GLRaV-3的检出率最高，达 50.00%，其次为GRSPaV和GINV，检出率分别为42.00%和46.00%，GFLV的检出率最少，仅为4.00%。

表2 RT-PCR检测结果Table 2 Sequencing results of RT-PCR products

M.Marker；1.GLRaV-1；2.GLRaV-2；3.GLRaV-3； 4.GFLV；5.GRSPaV；6.GVA；7. GPGV；8.GINV

针对上述‘蛇龙珠’葡萄感染病毒后的4种后期症状类型(图1-f～i)分别进行RT-PCR检测发现，Ⅰ型症状检测到GLRaV-3、GFLV、GRSPaV和GPGV；Ⅱ型症状检测到GLRaV-1、GLRaV-3、GRSPaV、GVA、GPGV和GINV；Ⅲ型症状检测到GLRaV-3、GRSPaV、GVA、GPGV和GINV；Ⅳ型症状检测到GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GFLV、GRSPaV、GVA、GPGV和GINV。说明‘蛇龙珠’葡萄病毒病复合侵染严重，感染的病毒种类不同，其症状表现也不同。

2.3 病毒感染对‘蛇龙珠’葡萄光合指标的影响

由表3可知，与对照相比，罹病葡萄的叶片气孔导度和光合速率显著降低(P<0.05)，叶片气孔导度降幅为37.77%，净光合速率降幅为 17.21%；罹病葡萄的SPAD值极显著降低(P< 0.01)，降幅为14.89%。说明病毒感染导致葡萄光合作用减弱。

表3 病毒感染的‘蛇龙珠’葡萄光合指标Table 3 Photosynthetic index of ’Cabernet Gernischet’ grape under virus infection

2.4 病毒感染对‘蛇龙珠’葡萄果实品质的影响

如表4所示，罹病葡萄果实各成分的累积动态与对照组葡萄基本一致，pH、可溶性固形物、还原糖、百粒质量、花青素、总酚、糖酸比、固酸比随果实成熟总体呈现增加趋势，可滴定酸和单宁随果实成熟总体呈现下降趋势。

表4 ‘蛇龙珠’葡萄果实各理化指标检测结果Table 4 Testing results of physical and chemical indicators in ‘Cabernet Gernischt’

对比5次采样测定结果，在8月15日和8月28日罹病葡萄果实各成分含量与对照相当。自9月8日第3次采样一直到成熟采收，罹病葡萄果实各成分含量逐渐与对照形成差异，其中在9月20日差异最大。与对照相比，罹病葡萄的可溶性固形物含量呈极显著下降(P<0.01)，在9月20日降幅最大，为19.36%；罹病葡萄还原糖含量、糖酸比和固酸比在9月20日与对照差别达到极显著水平(P<0.01)，降幅最明显，还原糖含量降幅为18.09%，糖酸比降幅为25.24%，固酸比降幅为27.44%；罹病葡萄的可滴定酸含量在9月20日与对照相比呈显著增加(P<0.05)，增幅为 15.94%；罹病葡萄的pH和百粒质量在9月20日采样测定结果，与对照相比显著降低(P< 0.05)，pH降低1.83%，百粒质量降低9.51%；罹病葡萄的花青素、总酚和单宁含量与对照相比有所降低，但无显著差异。

表5 主成分方差分析Table 5 Analysis of variance of principal components

2.5 ‘蛇龙珠’葡萄适宜采收期的主成分分析

针对罹病和对照组葡萄的10 个果实品质指标5 批样品分别进行主成分分析，由表5可知，按主成分提取特征值需大于1的原则，罹病和对照组葡萄各提取2个有效主成分，其累计方差贡献率分别为74.028%和72.833%，具有一定的代表性，可进行进一步分析。

如图4主成分载荷图所示，罹病和对照组葡萄的PC1 都与pH、可溶性固形物、还原糖、百粒质量、糖酸比、固酸比具有较好的相关性，解释了这6 个变量在确定最佳采收期时所起到的作用，且主要都是反映葡萄浆果本身品质的指标；PC2 与总酚、单宁具有较好的相关性，解释了这2个变量在确定最佳采收期时所起到的作用，且主要都是反映葡萄浆果在酿造过程中较为重要的品质指标。

a.罹病葡萄的载荷图;b.对照组葡萄的载荷图a.Load diagram of infected grapes;b.Load diagram of CK

根据主成分分析得到的成分矩阵，计算特征向量矩阵，将所提取出的主成分分别表示为各变量的线性组合，得到主成分的函数方程式(1)～(4)。方程式(1)和方程式(2)为罹病葡萄两个主成分的函数方程，方程式(3)和方程式(4)为对照组葡萄两个主成分的函数方程。方程式中X1～X10分别代表pH、可溶性固形物、还原糖、可滴定酸、百粒质量、花青素、总酚、单宁、糖酸比、固 酸比。

F1=0.343X1+0.343X2+0.334X3- 0.340X4+0.335X5+0.230X6+0.240X7- 0.177X8+0.377X9+0.376X10

(1)

F2=-0.101X1-0.114X2+0.212X3- 0.056X4-0.158X5-0.159X6+0.558X7+ 0.715X8+0.161X9+0.059X10

(2)

F1=0.356X1+0.363X2+0.360X3- 0.336X4+0.273X5+0.214X6+0.218X7- 0.212X8+0.380X9+0.378X10

(3)

F2=-0.031X1-0.068X2+0.010X3- 0.148X4-0.094X5-0.383X6+0.650X7+ 0.612X8+0.110X9+0.095X10

(4)

F=0.838F1+0.162F2

(5)

F=0.861F1+0.139F2

(6)

对所有变量进行标准化处理，计算各个采收期所对应的F1和F2的得分，以F1和F2各自的特征值作为权重，进行加权处理，得到各个采收期的综合得分方程F，方程(5)和方程(6)分别为罹病和对照组葡萄不同采收期综合值F函数方程，并根据F值的大小对不同采收期‘蛇龙珠’葡萄的整体品质情况进行排名。综合得分越高，排名越靠前，说明该时期的葡萄品质越好，从而确定最佳采收期[23]。

从表6 可以看出，罹病葡萄品质综合排名在2020-09-27最高，对照组葡萄在2020-09-20最高，因此得出该年度该地区罹病‘蛇龙珠’葡萄的最佳采收期为9月27日，对照组的最佳采收期为9月20日，对比发现感染病毒后，葡萄的最佳采收期比健康植株晚了1周。

表6 在病毒感染下对‘蛇龙珠’葡萄不同采收期品质综合评价Table 6 Comprehensive evaluation of grape quality at different harvest time of ‘Cabernet Gernischet’ grape under virus infection

3 讨 论

目前国内各葡萄产区葡萄病毒复合侵染严重。范旭东等[14]采用小RNA测序技术从 ‘阳光玫瑰’葡萄样品测定到8 种病毒，其叶片呈现褪绿斑驳、畸形、小叶、反卷等症状；李晨等[24]研究发现在‘阳光玫瑰’‘巨峰’和‘玫瑰香’上存在2 种及以上葡萄病毒复合侵染的现象。本研究通过RT-PCR方法检测出贺兰山东麓地区‘蛇龙珠’感染了8种葡萄病毒，分别是GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GFLV、GRSPaV、GVA、GPGV、GINV，其中GINV在‘蛇龙珠’葡萄上为首次报道。此外，通过田间观察与RT-PCR检测发现‘蛇龙珠’葡萄感染病毒种类不同，所表现出的症状也不同，有些病毒在田间并不显示症状，存在潜伏侵染，应该引起相关部门对葡萄苗木繁育安全性的重视。

徐美隆等[25]研究发现葡萄感染病毒后，其SPAD值、叶片气孔导度和光合速率显著降低，本研究与其结果一致。对品质来说，同一采收时间，罹病葡萄的pH、可溶性固形物、还原糖、花青素、总酚、单宁含量与对照相比显著减少，可滴定酸含量增加，这与刘万好等[16]、于素珍等[26]有关葡萄卷叶病对果实品质影响的结果一致。葡萄酒酿造的最佳糖酸比为35～45，糖酸比太高或太低都会影响葡萄酒的口感[27]。贺兰山东麓产区由于昼夜温差大，健康的‘蛇龙珠’葡萄的糖度太高，酸度不足，酿造的葡萄酒结构性较差，表现出口感寡淡，而‘蛇龙珠’葡萄感染病毒病后，其酸度会增加，反而有利于酿酒葡萄达到最佳糖酸比。但考虑到葡萄一旦感染葡萄病毒，即终身带毒，病毒会逐年积累且通过苗木、接穗传播，对葡萄产业长久发展不利。因此，生产上必须加强葡萄苗木脱毒，促进产业健康发展。

传统的葡萄最佳采收期仅通过测量果实含糖量、含酸量和果粒质量等指标来确定，忽略了酚类物质等其他重要参数对葡萄品质的影响，而利用主成分分析则能全面客观地确定葡萄最佳采收期[28]。本研究利用主成分分析发现罹病葡萄的最佳采收期比对照组葡萄晚了1周，这与Montero等[29]研究发现葡萄感染GLRaV-3延缓了葡萄的成熟结果一致，进一步验证了葡萄病毒感染会延迟葡萄浆果成熟。

宁夏贺兰山东麓‘蛇龙珠’葡萄感染8种葡萄病毒，复合侵染严重，葡萄感染病毒病后，降低光合作用，影响果实成熟，造成葡萄采收时间的推迟。对于光热充足、栽培规模较大的葡萄产地，可通过延后采收，降低葡萄病毒病的影响。鉴于葡萄病毒病尚无有效药剂进行防治，生产中还应选用脱毒苗木，避免葡萄病毒病大肆传播。