43份汉中茶树种质资源叶片解剖结构分析

李 佼，李豆豆，王 令，吴军舰，席彦军，王思梅，蒲国涛，陈 钦

(1.汉中市农业技术推广与培训中心，陕西汉中 723000；2.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西汉中 723000；3.汉中市农产品质量安全监测检验中心，陕西汉中 723000)

茶树(Camelliasinensis)是重要的经济作物和饮品之一。茶树叶片不仅是茶树供人品饮、经济产出的对象，也是茶树进行生理代谢的重要器官，叶片解剖结构与品种遗传特性和环境联系密切，直观体现茶树对环境的适应和反应[1]。叶片解剖结构鉴定可作为评价茶树生理活性、抗逆性、生产力和品质等性状优劣的重要手段，为茶树品种选育提供理论依据[2]。近年来，有关茶树叶片解剖结构分析研究在茶树种质资源评价中得到广泛应用[3-7]。

陕西南部属于高纬度的江北茶区，是中国北缘名优绿茶适生区。与南方茶区相比，陕南茶园大多是高山茶园，冬季低温持续时间较长，较易发生冻害，严重时会影响茶园的产量、茶叶品质以及经济效益[8]。除冻害外，病虫害、干旱等胁迫也会影响茶树的产量、茶叶的品质[9-10]。因而陕西栽植茶树对品种的抗性有更高的要求。陕西汉中种茶历史悠久，境内保存很多宝贵的茶树种质资源。汉中茶树地方品种大体分为西乡大河群体种、南郑碑坝群体种、镇巴紫阳群体种和宁强广坪群体种[11]。经过长期的自然选择，本地群体种具有抗性强、内含物丰富的优势，从中选育优质高抗的本地品种是茶叶科研的重点方向。

已有的研究从表型性状、生化成分和抗逆性等方面对陕西种质资源进行研究，并取得一定成果，但未从叶片解剖学角度系统评价[12-15 ]。汉中市农业科学研究所保存有400余份陕西茶树群体种资源。本试验选取43份来自本地不同群体的优良株系，运用隶属函数法和与抗寒性相关的线性回归方程对其叶片解剖结构指标进行分析，初步评价汉中群体种茶树资源的多样性与抗逆性，旨在为汉中茶树本地群体种资源的鉴定评价提供参考，加快本地茶树良种的选育进程。

1 材料与方法

1.1 试验材料

43个无性系茶树资源叶片采自位于南郑区法镇的茶叶综合试验基地(西经 107.06°，北纬 32.89°)，材料信息见表1。

表1 供试材料基本信息Table 1 Information of tested materials

1.2 主要试剂

70%(体积比)乙醇的FAA固定液(每100 mL含福尔马林5 mL、冰醋酸5 mL、70%乙醇90 mL)、无水乙醇、二甲苯、1%番红水溶液(番红染色剂)、0.1%固绿乙醇溶液、石蜡、加拿大树胶均购自汉中兴盛化玻有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集 2020年9月初采集样品，每份无性系材料选择10株长势大致相同的植株，从每株树冠当年生第一轮新梢芽下第4叶位随机采一片，共10片鲜叶[1,5]。沿叶片中部靠近叶脉两侧剪取约5 mm×10 mm的组织块，然后置于FAA固定液，10 ℃左右固定3 d后备用。

1.3.2 组织切片制作 采用石蜡切片法制作叶片横截面组织切片，主要过程包括乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋和徕卡切片机切片，展片和贴片，番红固绿染片，加拿大中性树胶封片，制成永久切片保存，以备后续观察。每份株系制5张切片，每个切片包埋3～5个组织，共215张。

1.3.3 组织切片观测 将切片置于显微镜(Olympus BX53)下观察并拍照测量。选择同一株系的数条组织切片中染色清晰结构完整的切片进行观测。测量叶片的上角质层厚度(thickness of upper epidermis’ cuticle，TUC)和下角质层厚度(thickness of lower epidermis’ cuticle，TLC)、上表皮厚度(thickness of upper epidermis，TU)和下表皮厚度(thickness of lower epidermis，TL)、栅栏组织厚度(thickness of palisade tissue，TP)、海绵组织厚度(thickness of spongy tissue，TS)、叶片总厚度(leaf thickness，LT)、第一层栅栏组织400 μm范围内细胞个数(the cell amounts in the first layer of palisade tissue in the range of 400 μm，CA)和栅栏组织层数(layers of palisade tissue，LP)9个指标，每份组织条取3个视野观察拍照，每份材料观测5个组织条带，取平均值作为各项指标值。

1.4 数据处理

对观测的9个指标进行统计，分别计算栅栏组织厚度/海绵组织厚度( P/S)、海绵组织厚度/叶片总厚度(S/L)、上表皮厚度/海绵组织厚度(U/S)、栅栏组织厚度/叶片总厚度(P/L)、海绵组织厚度/栅栏组织厚度(S/P)、抗寒性得分(Y)、生产力指数(N)。采用Shannon-Weave 指数法计算各群体资源的遗传多样性指数(H′)。

生产力指数(N)按照公式(1)进行计算[2]；抗寒性得分(Y)按照式(2)进行计算(其中X= P/S)[5]；采用隶属函数法计算各茶树株系的抗旱性和抗病虫性[5]，具体算法见式(3)(其中xi是各项指标量的定值，xmin、xmax是指所有群体叶片解剖结构某一指标的最小值和最大值)，最后计算各株系叶片解剖结构中与抗性有关的指标的平均隶属函数值，其数值大小与茶树抗逆性呈正相关。

N=400 μm范围内第一层栅栏组织细胞 数×栅栏组织厚度

(1)

Y=5.47X-1.78

(2)

F(xi)=(xi-xmin)/(xmax-xmin)

(3)

式中i为1,2,…,43。

以IBM SPSS 23统计软件进行聚类分析、方差分析、主成分分析，综合评价各群体的特征。其中，主成分分析中提取特征值大于1.0 的因子作为主成分，计算每个主成分的方差贡献率和累计贡献率。以离差平方和Ward’s method进行聚类分析，采用LSD法对聚类群体的解剖指标进一步比较分析。

2 结果与分析

2.1 汉中茶树资源叶片解剖特征与遗传多样性分析

根据切片显微观测结果(图1)和相关指标统计分析(表2)可知，43份资源中HCB10的栅栏组织最薄，P/S最低，导致其生产力指数 (1 653.87)和抗寒性得分最差(-0.02)；HCQ04栅栏组织较厚，其抗寒性得分最高(2.65)。

图1 部分茶树资源叶片横切面Fig.1 Transverse sections of some tea trees

表2 叶片解剖结构指标统计及遗传多样性分析Table 2 Basic statistic parameters and diversity indexes of anatomical structure traits of leaves

16项指标的遗传多样性指数大于2.0的有5项，其中，U/S遗传多样性最大，达到2.15；其次是LT、CA、TS、TL，分别为2.12、2.06、2.02、 2.01。上述结果表明，除了栅栏组织层数以外，汉中茶树群体资源的叶片解剖结构具有较丰富的遗传多样性，遗传改良潜力较大。

变异系数能反映同一性状指标在不同茶树资源间的变异程度。分析43份资源各变异系数位于5.40%～31.78%。其中变异系数最大的是抗寒性得分(31.78%)，其次是S/P(15.12%)和生产力指数(13.83%)，最小的是细胞个数 (5.40%)。变异系数分析结果表明，汉中不同群体茶树资源的叶片解剖结构出现较明显的变异。

2.2 汉中茶树资源聚类分析

43份汉中茶树资源聚类分析结果显示，当距离值为5.0时，43份材料聚为4个类群，其中第Ⅰ类群包括9份茶树资源；第Ⅱ类群包括15份茶树资源，第Ⅲ类群包括2个亚群，18分茶树资源；第Ⅳ类群仅有1份茶树资源(HCB10)(图2)。

图2 43份茶树资源叶片解剖结构性状聚类图Fig.2 Clustering map of 43 tea materials based on traits of leaf anatomical structure

2.3 汉中茶树资源的抗逆性评价

表3展示了与抗逆性相关的7项叶片解剖结构指数及其平均隶属值，综合评价不同茶树资源的抗病虫性和抗旱性。

2.3.1 抗旱性分析 叶片角质层的蜡质透水性弱，具有防止水分散失的作用，因此角质层厚度和叶片厚度可作为抗旱性的重要鉴定指标之一[16]。采用隶属函数法计算43份资源的叶片TUC、LUC、TP、LP、P/S、LT和LU 7个指标来评价其抗旱能力。通过表3可知，43份资源的抗旱性平均隶属函数值位于0.12～0.91，平均值为0.61，表明资源整体抗旱性较强。其中排在前3的群体为：HCQ04>HCX05>HCB07，其抗旱性平均隶属函数值在0.80及以上，具有较强抗旱性。抗旱性最弱的3个资源为HCB02

表3 43份汉中茶树资源的隶属值与抗性分析Table 3 Membership function value and resistance evaluation of 43 tea materials in Hanzhong

2.3.2 抗病虫性分析 研究表明，TUC、TL、TLC、LT、TP、LP以及P/S与茶树抗病虫性密切相关[2,6,9]。利用隶属函数法计算43份材料这7项指标的抗病虫性隶属值，位于0.28～0.87，平均值0.56，表明所选资源整体抗病虫性较强。其中HCQ04、HCX05和HCB03排在前3位，平均隶属值均大于0.7，表明该3份资源抗病虫性优于其他。

2.3.3 抗寒性分析 茶树抗寒性与叶片解剖结构紧密相关，栅栏组织越厚、细胞层数越多、排列越紧密、P/S值越大，茶树的抗寒性就越强，因此可以把TP、TU、P/S、CA以及P/L等指标用于鉴定茶树的抗寒性[2,17]。采用回归方程(公式2)计算抗寒性得分，得分越高，表明抗寒性越强[10,17]。由表2可知所选资源抗寒性得分在 -0.02～ 2.65，抗寒性最强的是HCQ04(2.65)，抗寒性最差的是HCB10(-0.02)。在43份资源中有41个资源的抗寒性得分大于1.0。

2.4 汉中茶树资源的适制性分析

根据束际林[2]的研究，茶树叶片解剖结构指标与其适制性密切相关，栅栏组织越厚，叶绿体含量高，其胡萝卜素和叶黄素含量越高，适合加工绿茶或乌龙茶。表1表明，有42份资源的栅栏组织厚度大于75 μm，41份资源P/S值大于0.5，上表皮较厚，适制绿茶。此外，HCB10和HCZ02的海绵组织厚度分别达到185.99 μm和183.50 μm，S/P值为2.4和3.11，表明其海绵组织发达，液泡体积大，茶多酚含量高，适制红茶[2,17]。从叶片解剖角度说明，汉中茶树资源大部分适制绿茶，少数资源适制红茶或红绿兼制。

2.5 汉中茶树资源生产力水平分析

茶树有机物的积累依靠光合作用，光合作用越强，茶树的生产力即产量就越高，栅栏组织是光合作用的主要场所。有研究表明，光合强度与CA和TP相关[1,2,18]。从表2可知，43份资源生产力指数N在1 653.87～3 765.83，平均值达到3 002.28，生产力指数总体较高。其中，有24份资源生产力指数超过3 000，具有高产性状；有18个资源生产力指数在2 000～3 000，属于中水平；只有HCB10生产力指数低于2 000，属于较低水平。生产力指数最高的是HCQ02，生产力指数高达3 765.83。

2.6 汉中茶树叶片解剖结构指标的主成分分析

对43份茶树资源的叶片解剖结构指标进行主成分分析，提取特征值大于1的前4个成分，其累计贡献率达82.91%，包含了16个指标的绝大部分信息(表4)。PC1的贡献率为46.86%，其中P/L、P/S和抗寒性贡献最大，TP和LP次之， S/P和S/L的影响为负，主要反映的是茶树的抗逆性和绿茶适制性相关性状。PC2的贡献率为 17.11%，其中LT贡献最大，TS和TP次之，主要反映生产力和红茶适制性相关性状。PC3贡献率为11.06%，TLC贡献率最大，TU、U/S和TL次之，主要反映与抗病虫性相关性状。PC4的贡献率为7.88%，CA贡献率最大，TUC、TL次之。

2.7 汉中茶树资源的综合评价

根据43份资源的前4种主成分和相应特征值(表4)，建立线性方程Zi=0.565 17Z(i,1)+ 0.206 33Z(i,2)+0.133 43Z(i,3)+0.095 06Z(i,4)，计算各资源主成分的综合得分并排序，结果见表5。结合图1聚类分析和表5排序结果，综合得分前9位的汉中茶树资源主要分布在第Ⅰ类群，主要表现为栅栏组织和叶片较厚、生产力指数和抗逆性得分高、S/P值低等特征，表明该类茶树资源适制绿茶，具有高产潜力，是选育名优绿茶品种的优势资源。综合得分后10位的茶树资源主要分布在第Ⅲ和第Ⅳ类群中，其中第Ⅳ类群的HCB10得分最低，此外其他9个资源中的8个聚集于在第Ⅲ类群的同一亚群，表现为叶片和栅栏组织薄，P/S和P/L值低，S/P和S/L值高，生产力指数低和抗寒性得分低，综合表现较差。

表4 叶片解剖结构指标主成分分析Table 4 Principal component analysis of anatomical structure traits of leaves

表5 43份汉中茶树资源的主成分得分Table 5 Score of principal components of 43 tea materias in Hanzhong

3 讨 论

陕西茶树本地群体种资源丰富，已开展的遗传背景研究、生化成分分析和表型性状分析等均表明陕西茶树种质资源遗传多样性较丰富[12,19]。本研究从叶片解剖结构性状的角度分析，16项指标除栅栏组织层数和S/P值外，其他指标遗传多样性指数在1.80～2.15，具有比较丰富的遗传多样性，进一步证实陕西汉中是茶树品种改良的资源宝库。

生产力指数是茶树资源的重要经济指标，43份汉中茶树资源中24份的生产力指数大于 3 000，比例高达55.8%，生产力2 000～3 000的资源占比为41.9%。王飞权等[5]研究发现70份武夷茶树资源中，14份资源的生产力大于3 000，占比为20.0%；生产力2 000～3 000的资源比例为72.8%。相比较，汉中茶树群体中具有高产潜力的资源较多。

植物的抗逆性是叶片解剖结构中多项指标综合作用的结果，难以用单一的解剖结构指标进行评价排序。隶属函数法将与抗性密切相关的指标结合，系统分析，能够提高评价的准确性[5,20-23]。本研究从叶片解剖学角度分析汉中茶树群体种资源抗病虫性、抗寒性和抗旱性。由于汉中位于中国茶区最北缘，抗寒性是茶树品种选育的关键指标之一。43份汉中茶树资源中，抗寒性得分最高的前4位中西乡群体占据3席，该结果与武艳等[24]发现西乡大河群体茶树资源抗寒性较强结果一致。

本研究采用主成分分析法，从43份资源中筛选出生产力指数、抗性综合得分前3的资源HCQ04、HCX05和HCM01，可作为选育高产高抗绿茶品种的对象重点观测。但茶树生长的环境条件、栽培方式等因素可能会影响叶片解剖结构的指标，因此下一步研究，还应结合田间调查、加工适制性研究等方式开展鉴定和株系比较试验，加快选育汉中本地茶树良种。