甲状腺乳头状癌基因突变与其侵袭性相关性研究

张 冉，杨 洁，冯恩梓，袁晓凤，王 清

（昆明医科大学第三附属医院头颈外科，云南 昆明 650118）

甲状腺癌是我国最常见的头颈部肿瘤之一。2020 年全球新发甲状腺癌病例数约为58 万，发病率在所有癌症中位列第11 位[1]，其中甲状腺乳头状癌（Papillary Thyroid Carcinoma PTC）是甲状腺癌中最多见的类型。通过手术以及I131 综合治疗，PTC 预后总体较好，然而其中一部分PTC 依旧表现出较强的侵袭性，颈部淋巴结转移、腺外侵犯不仅增加了手术难度，导致肿瘤组织不能够完全切除，而且增加了肿瘤复发的风险以及影响患者的生存质量[2，3]。国内BRAF V600E 鉴别细针穿刺性质不明确的肿瘤应用已较为广泛，然而基因突变关于预判PTC 侵袭性及预后方面的实际应用却相对较少，然而这对预测患者预后有巨大的潜在价值，一项meta 分析显示BRAF V600E 突变的PTC 患者淋巴结转移的概率明显提高[4]，还有研究联合穿刺细胞学及BRAF V600E 突变也显示BRAF V600E 突变的PTC 侵袭性更强，并在一定程度上能够预测PTC 淋巴结转移的发生[5]。本研究除了研究比较热门同时也是应用比较成熟的BRAF V600E，还纳入 了TERT，RET，RAS，TP53，CCDC6，NTRK，ETV6 共8 个基因进行分析，对各基因突变组与与野生型组的临床病理特征进行对比，探究各基因突变与PTC 病理特征的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

本研究回顾性纳入2018 年4 月至2022 年4月就诊于昆明医科大学第三附属医院并且有完整的基因信息、病理资料、临床资料的PTC 患者，纳入标准：（1）本院行甲状腺叶切除+中央区淋巴结清扫术且术后病理类型为甲状腺乳头状癌；（2）有完整的临床病理资料；（3）为初治病例，未接受过放化疗；（4）无同期其他原发癌及远处转移。收集到样本总数114 例，<55 岁91 例（79.8%），≥55 岁23 例（20.2%），年龄最小18 岁，最大78 岁，平均年龄43.11 岁，年龄中位数43 岁，男性23例（20.2%），女性91 例（79.8%）。

1.2 方法

1.2.1 基因检测对术后肿瘤样本核酸提取后进行文库构建和探针捕获，采用高通量测序技术（Next Generation Sequencing NGS）对21 个实体瘤相关突变进行检测，包括BRAF、AKT1、KRAS、NRAS、HRAS、PIK3CA、CTNNB1、GNAS、TSHR、TERT、RET、NTRK1、ALK、PTEN、TP53、PAX8、RASAL1、PDGFRA、EIF1AX、ETV6、TSC2，其中BRAF、RET、NTRK、ALK、PAX8、ETV6 同时检测融合突变的基因，例如：RET 同时检测融合突变基因：CCDC6，TERT 同时检测启动子区域的基因，测序平台为illumina，分析软件为癌症基因突变信息分析系统，基因检测由昆明医科大学第三附属医院医院分子检测中心完成，检测报告由昆明医科大学第三附属医院分子检测中心出具。

1.2.2 回顾性收集符合入组标准患者的年龄（年龄分层按照第八版AJCC 分期系统分层）、性别、多发癌灶、侵犯包膜、中央区淋巴结转移及淋巴结转移数目，侧颈淋巴结转移及淋巴结转移数目，T 分期，N 分期，M 分期，术前Tg-Ab，TPO-Ab等临床病理资料，以及基因资料，以各基因突变组作为观察组，野生型组作为对照组，以上临床病理特征为观察指标，对比各基因突变组与野生型组在临床病理特征的差异（表1，表2）；多基因突变作为观察组，单基因突变型作为对照组，以上述临床病理特征为观察指标，对比多基因突变与单基因突变临床病理特征差异，探讨基因突变数量与其侵袭性的关系（表3）；参照cN0 诊断标准：临床触诊颈部未发现明显淋巴结肿大或增大淋巴结最长径不超过2 cm，且质地柔软；常规影像学检查，包括高频超声检查及颈部CT 检查等为未发现异常增大淋巴结，且淋巴结内无囊性变、点状强回声、皮髓质结构消失、分界不清等超声现象，从cN0 患者中筛选出BRAF V600E 单基因突变及无基因突变的PTC 患者，以BRAF V600E突变作为观察组，无基因突变作为对照组，中央区淋巴结转移及淋巴结转移数目为观察指标，对比BRAF V600E 突变与无基因突变的PTC 在中央区淋巴结隐匿性转移的差异。

表3 98 例单基因突变与多基因突变病理特征的单因素分析Tab.3 Single factor analysis of pathological characteristics of 98 cases of single gene mutation

1.3 统计学处理

采用SPSS25.0 统计软件进行统计学分析，计数资料采用频数（百分比表示），组间比较采用卡方检验，非正态分布的计量资料的比较采用非参数检验。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

基因突变情况：21 个基因中有突变基因8 个：BRAF V600E 突变87 例（76.3%），其中单基因突变 81 例（71.1%），BRAF V600E+TERT 3 例（2.6%），BRAF V600E+TP53 2 例（1.7%），BRAF V600E+RAS 1 例（0.9%）；TERT 突变4 例（3.5%），其中 BRAF V600E+TERT 3 例，TERT+RETCCDC6 融合1 例（0.9%）；RAS 突变3 例（2.6%），均为NRAS 突变，其中2 例为单基因突变，BRAF V600E+RAS 1 例；RET 突变6 例（5.3%），其中单基因突变3 例，RET-CCDC6 融合2 例（1.7%），TERT+RET-CCDC6 融合1 例（0.9%）；CCDC6 突变3 例（3%），其中RET-CCDC6 融合2 例（1.7%），TERT+RET-CCDC6 融合1 例（0.9%）；TP53 突变3 例（2.6%），其中BRAF V600E+TP53 2 例（1.7%），TP53+ETV6-NTRK3 融合1 例（0.9%）；NTRK3 和ETV6 突变 3 例（2.6%），其中 TP53+ETV6-NTRK3 融合1 例（0.9%），另外2 例（1.7%）均为ETV6-NTRK3 融合突变。12 例（10.5%）为2 个及2 个以上多基因突变，单基因突变86 例（75.4%），16 例无基因突变。临床病理资料：多发病灶54例（47.4%），包膜侵犯30 例（26.3%），中央区淋巴结转移78 例（68.4%），侧颈淋巴结转移28 例（24.6%）。BRAFV600E 突变组与野生型组：突变组中央区淋巴结转移占比较大，中央区转移淋巴结转移数量也较多（P<0.05），N1 占比较大，TPOAb 降低（P<0.05）；TERT 突变组与野生型组：TERT 突变组老年占比较大，男性占比较大，侧颈淋巴结转移患者占比较大，侧颈淋巴结转移数量较多，T 分期较晚（P<0.05）；RET 突变组与野生型组：侧颈淋巴结转移患者占比较大，侧颈淋巴结转移占比较大，T 分期较晚（P<0.05），NTRK3 与ETV6 均为融合突变，结果一致：突变组侵犯甲状腺包膜占比较大（P<0.05）；RAS 突变组与野生型组：Tg-Ab 水平较低（P<0.05）；TP53，CCDC6 突变组与野生型组，差异均无统计学意义（P≥0.05）；多基因突变组与单基因突变组：多基因突变组侵犯包膜占比较大，侧颈淋巴结转移占比较大，侧颈转移淋巴结数量较多，M 分期较晚（P<0.05）；cN0 患者中BRAF V600E 突变组与无基因突变组，突变组中央区淋巴结转移占比较大，中央区转移淋巴结数目较多（P<0.05）。

3 讨论

虽然甲状腺癌相对其他恶性肿瘤预后较好，依旧有40%～90%的患者在初次手术中发现有颈部淋巴结转移[6−7]，肿瘤侵犯、淋巴结转移是甲状腺癌预后的重要影响因素[8]，而且随着PTC 发病率的不断攀升，中晚期难治性PTC 也越来越常见[9]。2003 年Cohen 等[10]首次提出BRAF 基因与甲状腺癌相关，随着测序技术的发展，在PTC 中一些新的突变基因被发现，然而关于一些突变基因导致的PTC 生物学行为却没有明确的定论。相较于一代测序（Sanger Sequencing）而言，二代测序有成本低、通量高、速度快等优点[11]。本研究就是基于二代测序进行的PTC 相关基因突变与其生物学行为的讨论，本次测序覆盖了21 个基因，检测了目标区域内的点突变，插入缺失突变，融合突变，拷贝数变异，全部患者114 例中检测到基因突变8 个。BRAFV600E 突变是目前已知PTC中最常见的分子缺陷，本研究中BRAF V600E 突变型87 例，突变率达76.3%，观察结果显示其突变型较野生型更容易发生中央区淋巴结转移，突变组73.6%，阴性组51.9%（P<0.05），多项研究也表明BRAFV600E 突变是PTC 中央区淋巴结转移的危险因素[12−14]，有文献报道[15]BRAFV600E突变是PTC 肿瘤多灶性及包膜外侵犯的危险因素，且相对于野生型表现出更强的侧颈淋巴结转移倾向，本研究结果显示BRAF V600E 突变与PTC 多癌灶性、包膜侵犯以及侧颈淋巴结并无显著性关联，这可能与一部分有多癌灶、包膜侵犯、侧颈转移的患者不愿意入组以及样本量偏小有关。反观TERT 突变型和RET 突变型比野生型均表现出更强的侧颈淋巴结转移的能力，T 分期也较晚，这两方面2 者表现出一定的一致性，TERT 侧颈淋巴结转移，突变组75%，阴性组22.7%（P<0.05），侧颈转移淋巴结转移数目，突变组5.50±7.14，阴性组1.15±2.48（P<0.05），除此以外，TERT 突变组相较阴性组诊断年龄更大，突变组60.75±12.82，阴性组42.46±11.01（P<0.05）。本研究中TERT 突变4 例，突变率为2.7%，相关研究也显示存在TERT 突变的PTC 有更强的腺外侵犯能力，是影响T 分期和诊断年龄的重要因素[16]，有研究报道TERT 和高龄患者存在关联[17]，与本研究结果一致。本研究中检测到的RAS 突变均为NRAS 突变，且突变型与野生型也并未表现出明显差异，本研究中，TP53 突变型与野生型在PTC 临床病理特征均无显著性差异，与国外一项研究一致[18]。

多基因突变中，3 例TERT 与BRAF V600E突变共存，TERT 突变已被证实与BRAF V600F突变存在协同相关[19]，相关研究[20]显示BRAF V600E 联合TERT 启动子突变与PTC 碘治疗疗效不佳显著相关，虽然本研究并未对碘治疗展开讨论，这也是TERT 突变型PTC 侵袭性强的一个表现，可为后续研究提供新的思路。有研究显示BRAF V600E 和TERT 启动子突变与淋巴结转移、多灶性转移、远处转移、甲状腺外扩散显著相关[21，22]，由于样本量的限制，本研究并没有做BRAF V600E 单基因突变与其他基因突变共存的对比，本研究把2 个及两个以上基因突变归为多基因突变组，与单基因突变比较观察，观察结果（表3）显示多基因突变的 PTC 与包膜侵犯、侧颈淋巴结转移以及远处转移显著相关，而中央区淋巴结转移并没有表现出显著差异，包膜侵犯：单基因突变25.6%，多基因突变66.7%（P<0.05），侧颈淋巴结转移：单基因突变：18.6%，多基因突变：66.7%（P<0.05），M 分期也有显著性差异，多基因突变较BRAF V600E 侵袭型更强也主要表现在这三方面，相关研究也显示多基因突变可能比单基因突变有更强的侵袭性[23]。国内关于RETCCDC6 融合突变的相关报道较少，本研究3 例RET 基因与CCDC6 融合突变，与各病理特征相关性分析也并没有统计学差异，为意义不明确的突变类型。ETV6-NTRK3 融合突变也少见报道，本研究中有3 名患者存在NTRK-ETV6 融合突变，在包膜侵犯上较阴性组更强，有研究报道ETV6-NTRK3 融合突变可能与辐射暴露有关[24]，2011年福岛核泄漏福岛核泄漏发生后，一项研究收集了2013 年至2016 年在福岛医科大学医院接受PTC 手术的136 名患者，发现6 名患者ETV6-NTRK3 融合突变，突变率为4.3%[25]，本研究的突变率为2.1%，为本研究的2 倍。

PTC 转移最多见的就是中央区淋巴结转移，再通过中央区向侧颈淋巴结转移，很少一部分患者会直接转移至侧颈淋巴结，所以国内大部分PTC 切除原发灶的同时会同时进行预防性中央区淋巴结的清扫，然而中央区淋巴结清扫也存在一定的潜在风险，比如甲状旁腺损伤导致术后低钙血症以及喉返神经损伤的风险增高。所以，对cN0 的PTC 患者是否行预防性中央区淋巴结清扫一直存在争议[1]。本研究从所有患者中筛选出cN0 患者，以BRAF V600E 单基因突变以及无基因突变进行分组，以中央区淋巴结转移以及中央区转移淋巴结的数目进行比较，观察发现有BRAF V600 突变的患者更容易发生中央区淋巴结转移，中央区淋巴结转移BRAF V600F 单基因突变组47.6%，无基因突变组9.1%（P<0.05），中央区转移淋巴结数目BRAF V600F，突变组2.10 ±2.54，无基因突变组0.09±0.30（P<0.05），相关研究也显示术前 BRAF V600E 突变阳性的患者发生隐匿性中央淋巴结转移的可能性显着更高[26]，见表4。该研究也有许多不足之处，样本量太小，特别是一些罕见的基因型，让统计分析较困难，未对甲状腺乳头状癌进行进一步的分型，一些侵袭性高的病理亚型可能与某些基因的突变型有关，希望后续研究可以进一步扩大研究样本量，以及对PTC 进一步细分亚型进行研究。

表4 53 例cN0 患者BRAF V600E 突变与无基因突变中央区淋巴结转移的比较Tab.4 Comparison between braf v600e mutation and central lymph node metastasis without gene mutation.

综上所述，基因突变和PTC 侵袭性存在相关性，PTC 中BRAFV600E 突变侵袭性主要表现为中央区淋巴结转移率更高。多基因突变的侵袭性较BRAF V600E 突变更强，主要表现在甲状腺包膜的侵犯率更高，侧颈淋巴结转移率更高，侧颈转移淋巴结数目较多，M 分期更晚。cN0 患者中存在BRAF V600E 突变的患者更容易发生中央区淋巴结的转移，BRAF V600E 突变可为PTC 患者个体化治疗提供一定的参考。