不同品种灵芝子实体及孢子粉元素成分分析及重金属安全性评价

潘少香，赵岑，闫新焕，李洪霄，刘雪梅，宋烨，吴茂玉，马超，熊永星*，郑晓冬*

（1.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东省果蔬贮藏加工技术创新中心，山东济南 250014）

（2.聊城市农业科学院，山东聊城 252000）

灵芝（Ganoderma lucidum）是担子菌纲（Homobasidiomycetes）多孔菌科（Polyporaceae）灵芝属（Ganoderma）真菌，是一种食药两用的真菌，具有抗肿瘤、调节免疫等作用[1,2]。灵芝孢子粉是灵芝生长成熟时从菌盖弹射出来的淡雾状的极其微小的孢子，主要含有多糖类、三萜类、甾醇类和生物碱类等活性成分，具有抗癌、保肝、降血脂、降血糖、抗缺氧、抗炎、清除自由基以及免疫调节等多种药理学作用[3-5]。我国是世界上灵芝主要的生产国和出口国，2019年灵芝产量18.55万t，占全球产量的75%。目前灵芝的种植以人工栽培为主，我国灵芝种植主要分为四大种植区域，分别为闽浙的武夷山及龙泉区域、东北吉林长白山区域、安徽一带大别山区域和山东鲁西区域，这四大区域的孢子粉产量占全国总产量的 60%以上[6]。赤芝、美芝、新大片是目前市场主栽的灵芝品种，藏芝、香血芝因其价值较高在山东鲁西区域逐渐被引进种植。

灵芝子实体和孢子粉中含有钙、镁、铁、锌、铜、硒等丰富的微量元素，其中丰富的硒元素越来越引起学者的关注[7]。灵芝孢子粉作为保健品，越来越受到人们的青睐，其安全性也倍受关注。由于近年来环境污染严重，灵芝孢子粉易受污染，特别是有害重金属的蓄积问题[8,9]。灵芝孢子细胞壁极为坚固，由几丁质、纤维素和木质素等物质组成，直接服用很难被胃酸消化，在实际应用中，将灵芝孢子粉破壁后食用，或破壁提取灵芝孢子粉有效成分食用是主流服用方式[10]。目前主要工业应用的灵芝孢子粉破壁加工方法是机械破壁法[11]，机械方法常会增加破壁灵芝孢子粉金属元素含量，甚至造成超标[6,11-13]，因此对于破壁灵芝孢子粉的金属元素含量评估是非常重要的。

本研究针对我国鲁西地区主栽灵芝品种，利用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定灵芝子实体及孢子粉中元素及重金属含量，开展元素质量及安全分析评价，同时研究目前破壁孢子粉企业广泛应用的挤压破壁方式对孢子粉重金属含量的影响，以期为灵芝子实体及孢子粉的生产和深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料

美芝、赤芝、新大片、香血芝、藏芝等灵芝子实体、孢子粉及破壁孢子粉样品均从鲁西地区灵芝生产基地采取，美芝、赤芝、新大片、香血芝、藏芝等灵芝子实体均为代料栽培灵芝，赤芝粉、美芝粉、新大片粉均为代料栽培灵芝孢子粉，赤芝椴木粉为椴木栽培灵芝孢子粉。

1.2 仪器与设备

WX-8000微波消解仪，上海屹尧仪器科技发展有限公司；ICAP电感耦合等离子体质谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；Milli-Q超纯水系统，德国默克密理博有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 元素检测方法

1.3.1.1 微波消解条件

称取0.3 g样品，于微波消解内罐中，加入5 mL纯硝酸，摇匀，放入微波消解仪中，按微波消解程序进行消解（见表1）。消解完成后，将消解罐转移至电热板上赶酸，赶酸至近干，加水溶解并转移至25 mL容量瓶中，定容，摇匀[14]。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion program

1.3.1.2 仪器工作参数

ICP-MS法仪器工作参数为：功率1 550 W，冷却气流量14.0 L/min，雾化气流量1.0 L/min，辅助气流量0.8 L/min，样品提升量4.0 L/min，采样深度7.8 mm，重复采样3次[14]。

1.3.2 孢子粉破壁率

孢子粉破壁率检测方法参照NY/T 1677-2008《破壁灵芝孢子粉破壁率的测定》[15]。

在进行施工准备工作前，一定要积极配合建设单位进行组织设计的交底工作，对于施工的设计文件一定要进行仔细的审核，也要结合实际的工程需要，进行必要的验证以及补测。对于可能发生塌方的区域，必须要做好一定的必要准备，在施工的过程中，必须做好相对应的预防措施。在必要的情况下，采取相对的应急措施以消除各种不利因素的影响。只有这样，才可以避免塌方的产生。由于隧洞的地质条件相对比较复杂，对于质量的监控以及地址预报的工作必须要做好。

1.4 数据分析

实验数据表示为平均值±标准差（mean±SD，n=3），每个样品重复3次，取平均值。实验数据采用DPS统计软件进行分析，方差分析（ANOVA）用于显著性分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义；点线图由Origin 9.0软件绘制完成，聚类热图由R软件分析完成，聚类方式采用欧氏距离法。

2 结果与讨论

2.1 不同品种灵芝子实体元素差异分析

利用ICP-MS法对赤芝、美芝、新大片、香血芝、藏芝5种灵芝子实体样品中K、Ca、Na、Mg、Al、Fe、Cu、Zn、Mn、Se、Ni、B、Ti、V、Co、Sr、Ba17种元素进行测定，测定结果见表2。除K、Ca、Na、Mg四种常量元素外，Fe、Cu、Zn、Mn 4种微量元素在5种灵芝子实体中含量相对较高，这与闫征等[16]、何晋浙等[17]研究结果一致。将5种灵芝子实体样品元素含量进行z-score标准化，消除各元素间量纲差异后做聚类热图，见图1。由图1可知，不同品种灵芝子实体样品中元素含量差异明显，藏芝和香血芝样品元素含量明显高于赤芝、美芝和新大片样品元素含量。

由表2可知，5种子实体常量元素含量差异显著，K含量范围1 178~5 999 mg/kg，Ca元素含量范围为186~1 235 mg/kg，Na元素含量范围62.3~113 mg/kg，Mg元素含量范围173~1 283 mg/kg。在Fe、Cu、Zn、Mn、Se、B、V、Co、Sr9种人体必需微量元素中，除B、Cu、Sr 3种元素外，藏芝子实体中其余6种微量元素含量均为最高，Fe元素含量达到234 mg/kg、Zn元素含量达到57.9 mg/kg、Se达到0.309 mg/kg。香血芝子实体样品B、Cu、Sr 3种元素含量最高，分别为5.75、54.1、3.60 mg/kg。5种灵芝子实体中赤芝子实体Fe、Cu、Se、Sr 4种微量元素含量相对较低，新大片子实体Zn、Mn、V、Co 4种元素含量相对较低；美芝子实体9种微量元素含量均高于赤芝和新大片样品，低于藏芝和香血芝子实体样品。由表2和图1可知，赤芝、美芝、新大片3种灵芝子实体微量元素含量低于藏芝和香血芝子实体，这可能是因为赤芝、美芝、新大片品种是经多年培育的产孢子粉灵芝品种，子实体元素品质质量稍差。

表2 不同品种灵芝子实体元素分布Table 2 Element content of different varieties of Ganoderma lucidum

图1 不同品种灵芝子实体元素聚类热图Fig.1 Cluster heat map of elements of different varieties of Ganoderma lucidum

2.2 不同品种灵芝孢子粉元素差异性分析

选取赤芝粉、美芝粉、新大片粉3种目前鲁西地区主要的灵芝孢子粉样品，同时以赤芝椴木粉为对照，分析赤芝粉、美芝粉、新大片粉3种孢子粉元素营养质量。4种孢子粉17种元素含量见表3。由表3可知，灵芝孢子粉中元素分布规律与灵芝子实体中元素分布规律相似，微量元素中Fe、Cu、Zn、Mn 4种微量元素含量较高，与程齐来等[18]研究结果一致。不同品种孢子粉元素含量差异显著，赤芝粉常量元素K、Ca含量较高，美芝粉常量元素Na、Mg含量较高，赤芝椴木粉常量元素Ca含量低于赤芝粉、美芝粉、新大片粉3种孢子粉，赤芝椴木粉K、Na、Mg 3种元素含量介于赤芝粉、美芝粉、新大片粉3种孢子粉之间。

表3 不同品种灵芝孢子粉元素分布Table 3 Element content of different varieties of Ganoderma lucidumspore power

2.3 灵芝子实体和孢子粉重金属安全性评价

对藏芝、赤芝、美芝、香血芝、新大片5种灵芝子实体和赤芝粉、美芝粉、新大片粉和赤芝椴木粉4种孢子粉样品中As、Pb、Hg、Cr、Cd 5种重金属进行检测，结果如图2。由图2可知，5种子实体样品中Hg元素均低于检出限（0.001 mg/kg），As元素含量范围为0.068 8~0.639 mg/kg，Pb元素含量范围为0~ 0.268 mg/kg，Cr元素含量范围为0.110~2.08 mg/kg，Cd元素含量范围为0.023~0.364 mg/kg。目前灵芝子实体重金属限量没有国家标准和行业标准，团体标准T/68C 002-2019《灵芝干品》[19]中仅对As、Pb、Hg 3种元素设定了限量要求（As≤1.0 mg/kg、Pb≤2.0 mg/kg、Hg≤0.2 mg/kg），团体标准T/JZLZ 003-2019《金寨灵芝》[20]中对As、Pb、Hg 3种元素也设定了限量要求（As≤0.9 mg/kg、Pb≤1.8 mg/kg、Hg≤0.1 mg/kg）。从5种灵芝子实体检测结果来看，Pb、Hg 2种重金属含量远低于相关团体标准限量要求，安全性较高，藏芝、香血芝As元素含量较高，具有一定的安全性风险。

图2 不同品种灵芝子实体及孢子粉重金属含量Fig.2 Heavy metal content in different varieties of Ganoderma lucidum and spore powder

4种孢子粉重金属检测结果见图2，由图2可知，赤芝粉、美芝粉、新大片粉和赤芝椴木粉4种孢子粉样品中Hg元素均低于检出限（0.001 mg/kg），As元素含量范围为0.063 7~0.689 mg/kg，Pb元素含量范围为0~0.291 mg/kg，Cr元素含量范围为0.035~0.204 mg/kg，Cd元素含量范围为0.043~0.144 mg/kg。目前灵芝孢子粉尚无国家标准，行业标准中只有供销行业标准GH/T 1335-2021《灵芝孢子粉》[21]，但标准中无对重金属的限量要求。团体标准如T/68C 002-2019《灵芝干品》[18]、T/JZLZ 003-2019《金寨灵芝》[19]对孢子粉中重金属限量与子实体一致，从4种孢子粉重金属As、Pb、Hg检测结果可知，孢子粉中Pb、Hg 2种重金属含量远低于相关团体标准限量要求，安全性较高，这与胡晓等[22]研究结果一致。新大片孢子粉中As元素含量较高，为0.698 mg/kg，具有一定的安全性风险。

2.4 破壁对孢子粉重金属含量的影响

对辊式挤压破壁技术是目前企业最常用的灵芝孢子粉破壁技术之一，实验对美芝、新大片、赤芝孢子粉原料及经对辊式挤压破壁的破壁孢子粉中As、Pb、Hg、Cd、Cr、Cu、Ni 7种重金属元素含量进行检测，三种孢子粉破壁后破壁率分别为96%、97%、96%，元素检测结果如图3。从图3可知，Hg元素在所有样品中均未检出，安全性较好。新大片孢子粉样品除As、Pb、Cd 3种元素破壁前后无显著性差异外，其余重金属含量均显著提高，重金属含量变化与沐华等[13]研究结果一致。其余孢子粉样品经对辊式挤压破壁后6种重金属元素含量变化与厉炯等[23]、邹小龙等[12]研究一致，均发生了显著提高。

图3 破壁对孢子粉金属元素含量的影响Fig.3 Effect of broken wall on the heavy metal element content of Ganoderma lucidum spore powder

《保健食品原料目录破壁灵芝孢子粉》[24]原料技术要求中对破壁孢子粉中As、Pb、Hg、Cr、Cd、Ni 6中元素有明确限量要求（As≤1.0 mg/kg、Pb≤2.0 mg/kg、Hg≤0.1 mg/kg、Cd≤0.5 mg/kg、Cr≤2.0 mg/kg、Ni≤ 1.0 mg/kg）。除《保健食品原料目录破壁灵芝孢子粉》原料技术要求外，供销行业标准GH/T 113-2017《灵芝破壁孢子粉》[25]对As、Pb、Hg三种元素也有明确限量要求（As≤1.0 mg/kg、Pb≤2.0 mg/kg、Hg≤0.3 mg/kg），As、Pb限量与《保健食品原料目录破壁灵芝孢子粉》原料技术要求一致，Hg限量较高。团体标准T/ZZB 0474-2018《灵芝破壁孢子粉》[26]中对Cd、Cr、Cu、Ni四种元素限量做出了明确要求，其中Cd≤0.5 mg/kg、Cr≤2.0 mg/kg、Cu≤20 mg/kg、Ni≤1.0 mg/kg，与《保健食品原料目录破壁灵芝孢子粉》原料技术要求中限量要求一致。经对辊式挤压破壁后，新大片粉Cu元素由12.0 mg/kg提高至16.8 mg/kg；赤芝粉As、Pb、Cr、Cd 4种含量分别由0.112、0.239、0.108、0.070 9 mg/kg提高至0.600、0.870、0.870、0.113 mg/kg，美芝粉As、Pb、Cr、Cd、Cu、Ni元素含量也有一定程度提高。因此在对辊式挤压破壁过程中孢子粉仍存在被重金属污染的风险，在实际应用过程中要严格控制破壁力度、破壁时间等相关破壁条件，减少重金属污染。

3 结论

藏芝和香血芝子实体大部分元素含量明显高于赤芝、美芝和新大片样品，特别是Fe、Cu、Zn、Mn、Se、B、V、Co、Sr 9种人体必需微量元素，新引品种藏芝和香血芝元素营养质量相对较高；赤芝粉和赤芝椴木粉元素营养质量高于美芝粉和新大片孢子粉元素营养质量，特别是孢子粉中营养元素硒，赤芝粉和赤芝椴木粉中硒含量分别是美芝粉中硒含量的3倍和2倍。研究结果对于优质灵芝品种及孢子粉品种的引育及推广具有重要的指导作用。

藏芝、赤芝、美芝、香血芝、新大片5种灵芝子实体及赤芝粉、美芝粉、新大片粉和赤芝椴木粉4种孢子粉样品中，Pb、Hg两种重金属含量远低于相关团体标准，安全性较高，藏芝、香血芝样品样品中As元素含量较高，说明藏芝、香血芝等引进品种在培育过程中对As元素的富集作用较强，具有一定的安全风险，在种植过程应严格控制培养基料中重金属As的含量。

不同品种灵芝孢子粉对辊式挤压破壁过程中As、Pb、Cd、Cr、Cu、Ni金属元素含量均有不同程度的提高，其中变化最为明显的赤芝粉经破壁后As、Pb、Cr、Cd 4种含量分别由0.112、0.239、0.108、 0.070 9 mg/kg提高至0.600、0.870、0.870、0.113 mg/kg，因此在对辊式挤压破壁过程中重金属元素含量仍存在一定的风险。破壁后孢子粉重金属含量增加，是因为对辊式挤压破壁机是由金属部件组成，高强度的破壁挤压会造成金属部件的磨损，从而使设备中的重金属进入孢子粉中。为避免重金属污染，实际应用过程中破壁功率、破壁时间等相关破壁条件还需进一步优化研究，同时改进破壁工艺，开发材质（如陶瓷）安全、易于推广的破壁设备，减少破壁过程的二次污染，也是孢子粉破壁设备未来研发的主要方向。