交叉引物扩增法检测食品中大肠杆菌不耐热肠毒素的探讨

李 伟，任重杰

（郓城县检验检测中心，山东菏泽 274700）

近年来，由于食品行业的迅速发展，食源性致病微生物引发的食物中毒、食源性疾病的发生率不断增加，给人们的健康和生活带来极大的威胁，同时也给我国的公共健康和经济带来了巨大损害。由于食物环境的原因，大肠杆菌不耐热肠毒素一直是引起食物中毒的主要原因。因此，快速、灵敏地检测出大肠杆菌不耐热肠毒素对食品安全管理具有重要意义。

1 交叉引物扩增法技术及应用

1.1 交叉引物扩增方法概述

交叉引物扩增技术是一种新的核酸等温扩增技术。交叉引物扩增技术采用一种DNA 聚合酶，在温度为62 ℃的恒温下保温1 h，即可特异、快速、高效地完成核酸的扩增[1]。本技术与快速检测技术（如快速检测纸条、一次性核酸检测设备）的组合，为临床快速检测、分子诊断、检疫和生物医药等领域的发展提供了新的检测方法。

1.2 交叉引物扩增方法特点

交叉引物扩增方法在检验检疫、检测突发传染病和医院的早期筛查中得到了广泛的应用。由于CPA 的成本较低，CPA 的扩增只能在离心机和诸如水浴、金属浴等简单的恒温装置中进行。由于其操作简单，且对操作者不具备太高的操作水平要求，一般人只要经过简单的训练或自学就可熟练使用，这为推广这项技术创造了良好的条件。该方法具有很好的特异性，能为6 个目标基因区设计6 ～8 条特异引物，以确保反应的特异性[2]。同时，其灵敏度高，可从少量复制中分离到目标基因，其敏感性能够达到10 个拷贝。产品的检测方法简单，特异性高，可用琼脂糖凝胶电泳法进行鉴定，也可将荧光染料添加到扩增产品中，根据颜色的改变来判断，也可采用一次性的抗污染核酸检测设备进行检测，降低了假阳性的发生概率。

1.3 交叉引物扩增反应原理

CPA 扩增系统主要由置换引物、交叉引物和Bst DNA 聚合酶组成，通过Bst DNA 聚合酶的链替换，可实现DNA 的连续重复扩增。CPA 的扩增过程包括以下几个步骤。①生成具有交叉引物位点的扩增产物。PFs 的5’末端和反交引物PRa 的杂交序列是一致的。在交叉引物的前面，排列着替代引物。取代引物的浓度比交叉引物要低。BST DNA 聚合酶可通过替换的方式，在不同的位置上不断地延伸出不同的交叉引物。固定的前链5’末端是由替换引子和交叉引子不断地扩展而形成的。PFa 也是同样的原理，它可通过伸展和排列来形成另外一条固定的链条[3]。②扩增交叉引物。该排列链由末端新生成的引物位点构成，并将其3’端交叉引物的导入点模板。利用引物的不断杂交、延伸以及扩增产物自身的杂交延伸，可形成多个引物杂交，加快扩增进程。③对产品的生成进行检测。在反应完成后，会产生一种单链、双链、半双链的混合物。

1.4 交叉引物扩增反应产物的检测方法

CPA 方法得到的核酸扩增产物在琼脂糖凝胶上显示为一条带状。通过电泳观察，可判断是否出现了一个梯度条。可将嵌入的荧光染料（乙溴锭、SYBR Green I）等加入反应系统，且根据反应溶液中荧光强度的改变判定产品的生成，从而判定是否有扩增反应。若将1 μm SYBR GreenI 型荧光染料加入双链DNA 的小沟中，在产生扩增产物时，可与DNA 双链连接，使荧光染料从橙色转变为绿色[4]。利用一次性的核酸检测仪和核酸膜色谱快速检查纸等产品，对显色试纸进行目视判读，只在C 质控区处有一条红线时，判定为阴性，即没有反应；若有两条红线，分别在T 检测区和C 质控区，判定为阳性，表示有反应，若无红线，则判定为无效。

2 材料与方法

2.1 模板的制备

用麦康凯琼脂平板37 ℃下培养C83903（LT’）菌株16 ～24 h。用LB 液为载体，在37 ℃下，用200 r·min-1的振荡试验研究了该菌的生长特性。将 5 mL 的培养基，在10 000 r·min-1下进行3 min 的离心，将上清液作为DNA 模板，贮存于-20 ℃的无菌环境下备用。

2.2 生猪肉人工随机污染

用麦康凯培养基C83903（LT′*）菌株在37 ℃下过夜培养，稀释1 000 倍后，将其稀释菌液与无LT毒素的猪肉样品进行混匀。在10 000 r·min-1的条件下离心3 min 后，将上清液排出，用1 mL 0.9%的生理盐水进行悬浮培养，再用肠毒素大肠埃希氏菌对样本进行人工污染，并进行记录。

2.3 特异性检测

采用14 个试验菌（6 个大肠杆菌和8 个非大肠杆菌），将其与LAMP 法进行对比。反应完成后，将预先滴入的SYBR GreenI 型荧光染料与所述扩增产品相混合，在自然和紫外线下进行观察，使用浓度为2%琼脂糖凝胶电泳技术对扩增产物进行检测。

2.4 人工污染生猪肉样本的检测

采用CPA 法、LAMP 法、qPCR 法，对人工感染经产肠毒素的大肠埃希氏菌生猪肉样本共计50 例进行了检验，采用DNA 萃取试剂对猪肉样品进行处理，以DNA 基因组为模板，以2%的琼脂糖凝胶电泳法检测CPA、LAMP 扩增产物，并与qPCR 进行对比。

3 结果与分析

3.1 检测方法的建立与优化

该引物的特异性较强， 在60 ℃、60 min 条件下可大量扩增LT 毒素，用2%的琼脂糖电泳法检测，其阳性呈不规则的梯形条纹，而在阴性对照组中无条带。用华峰管另一头的SYBR GreenI 染料与反应产物进行混合，用肉眼观察，在正试管中呈绿色，阴性试样为橙色；在紫外线的作用下，阳性管的荧光呈绿色，而阴性管则不变，如图1 所示。

图1 反应产物的阴性管与阳性管

通过实验，对反应温度、Bst 聚合酶、dNTPs、Mg、甜菜碱浓度和扩增时间进行了优化，发现62 ℃、 64 ℃、66 ℃是最佳的扩增温度；采用8 U/管Bst 聚合酶法进行扩增，得到的条带最明显，最佳的Bst聚合酶浓度是8 U/管；在0.3 mmol·L-1dNTPs 中，dNTPs 的扩增条件最为明显；实验结果表明，在 45 min 内，样品中有一条明显的阶梯状条纹，但随着反应时间的延长，条带的亮度没有显著的改变，因此45 min 是最佳的扩增时间。按上述原理进行CPA反应，最佳Mg 浓度为2.0 mmol·L-1，甜菜碱浓度为 0.8 mol·L-1。

3.2 特异性试验

采用CPA 法，对14 个不同的细菌进行了特异性测定，并重复了3 次。用琼脂糖电泳法测定了2 个带有LI+基因的菌株，其余12 个是未携带LI+基因的菌株，与LAMP 的检测结果相吻合，证明了该方法的特异度较高。

3.3 人工污染生猪肉样本检测结果

采用CPA 法和LAMP 法，对50 例无菌感染的猪肉样品进行了快速检测。结果表明，CPA、LAMP法各检测到7 个带有LT 的基因，与qPCR 的检测结果基本相符，其检出率为14%。

表1 临床样本检测结果（n=50）

4 结论与讨论

本文通过优化反应温度、酶浓度、dNTPs 浓度等因素，构建了一种快速、特异、灵敏度高的新型CPA探针。与LAMP 法比较，该方法特异性强，从加样到反应结束，只需1.5 h 就能完成目标基因的特异扩增，而对非携带目标基因的鉴定结果为阴性[5]。本文采用人工污染的生猪肉模拟样品，采用荧光PCR 技术，采用CPA、LAMP 法进行人工感染，其阳性检出率达到14%（7/50），表明CPA 是一种新的检测技术，可满足食品卫生领域微生物质量检验的需要。

CPA 扩增时，由于系统中DNA 的连续合成，会导致大量的焦磷酸镁沉淀，因此可通过是否有白色沉淀来判断，但当LT 毒素基因扩增时，没有发现明显的乳白色沉淀，而用2.0%的琼脂糖凝胶电泳法检测，可看到不同尺寸的区域带阶梯状结构[6]。为了避免在打开瓶盖时产生的大量气溶胶对周围环境的影响，本文选择广州华峰生物科技有限公司生产的华峰管进行可视化检测，将SYBR 绿色I 型染料和反应系统的混合液加入华峰管，使二者在反应结束后进行混合，以确定反应的效果，有效地防止了气溶胶所致的交叉污染。

综上，产肠毒素大肠杆菌是一种非常危险的病原体，会引起食源性疾病，因此建立一种快速、准确的检测方法，对于保证食物安全和人体的健康非常重要。交叉引物扩增法具有时间短、成本低、特异性高等优点，且无需特殊、昂贵的仪器和实验环境，为食品致病菌的检测开辟了一条新途径。