基于Wnt/β-catenin信号通路探讨枸杞多糖对压疮大鼠创面愈合的影响

马亮亮 张俊飞 田 芳 韩凤玉

压疮(pressure ulcer，PU)是由于局部组织长期受压，继而发生持续性缺血、缺氧及营养不良，从而导致组织发生了溃烂和坏死的疾病[1]。欧美等国家研究指出PU已经是继癌症和心血管疾病之后医疗花费最高的疾病[2,3]。目前关于PU的治疗主要包括药物疗法、手术、电刺激、封闭负压引流疗法和红外线光疗等方法[4,5]。比较手术等西医治疗方案，中医药外用膏剂、散剂、煎剂、艾灸、针灸和内服药物等方法在治疗PU方面也取得了很好的效果，并且患者治疗费用和接受度更高[6]。

产自宁夏回族自治区的枸杞是我国传统名贵中药之一，现代研究发现，从枸杞中提取的多种天然化合物具有多种药理活性，其中枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides，LBP)因具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤及免疫调节等多种药理作用备受关注[7,8]。同时研究发现，LBP在治疗皮肤损伤和溃疡中都表现出良好的化学活性[9]。此外，LBP已经被证明可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路减轻高血糖加重脑的缺血再灌注损伤和增加骨髓间充质干细胞的活化治疗骨质疏松[10,11]。但是LBP是否可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进PU创面的愈合尚不清楚，因此，本研究拟通过构建PU大鼠模型，探讨LBP是否通过Wnt/β-catenin信号通路促进创面愈合，从而为LBP临床治疗PU提供理论依据。

材料与方法

1.主要仪器与试剂：枸杞多糖(批号：MCA2016157)、水合氯醛(批号：P11259)、IL-6(批号：P1042)、IL-1β(批号：P1037)、TNF-α(批号：P1003)、SOD(批号：P1042)、MDA(批号：P 1040)和VEGF(批号：P1012)酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay， ELISA)试剂盒购自上海善然生物科技有限公司；Wnt1、β-catenin、GSK-3β和β-actin引物由上海英杰生物科技有限公司设计合成。RT-PCR试剂盒(批号：D7277S)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号：P0009)、Wnt1(批号：AF8349)、β-catenin(批号：AC106)、GSK-3β(批号：AF1531)和GAPDH(批号：AF1186)购自上海碧云天生物技术有限公司。实时定量Agilent PCR 仪购自美国安捷伦科技公司。

2.实验动物：SPF级雄性SD大鼠[许可证号：SCXK(宁)2015-0001]18只，6～8周龄。适应性饲养后严格按照动物实验伦理相关规定开展实验，本研究通过宁夏医科大学总医院医学伦理学委员会批准(伦理审批号：2020-096)。

3.动物模型制备：10%水合氯醛(0.3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，将其背部皮肤剃毛至表面无毛发，备皮区域面积约为10cm×5cm。将其背部皮肤提起后对称性扣上强力磁铁，靠磁铁的强大磁力作用对其进行压力损伤，造成压迫缺血，采用夹(缺血)12h再松(灌注)12h连续3个循环的造模方法对大鼠的皮肤造成损伤制备PU模型[4]。

4.分组和给药：将大鼠随机分为3组，每组6只大鼠，既对照组、模型组和LBP组。LBP组将LBP粉末溶于0.9%氯化钠溶液配制成LBP溶液，按照100mg/(kg·d)连续灌胃干预2周。对照组和模型组采用同等体积0.9%氯化钠溶液给予连续灌胃2周。实验执行期间所有实验动物均正常饮水饮食。给药后12h 10%水合氯醛(0.3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后进行组织取材。

5.创面愈合率的测定：参考高翔等[12]研究方法在治疗后第1天、3天、7天和14天进行大鼠PU创面愈合率计算[愈合率(%)=(造模后PU面积-治疗后PU面积)/造模后PU面积×100%]。通过ImageJ软件进行辅助计算。

6.HE染色：实验结束后对各组大鼠PU创面进行组织取材，组织进行4%多聚甲醛保存，按照组织病理学检测要求对组织进行石蜡包埋处理后，按照HE染色试剂盒相关说明书对组织进行HE病理染色检测，显微镜下观察并拍照。

7.ELISA法检测：大鼠麻醉后通过心尖采血，按照操作要求离心保存血清后参照肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的ELISA试剂盒说明书分别进行检测。

8.反转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测：对各组大鼠PU创面组织进行取材后，参考于泽洋等[13]研究方法进行，主要包括提取组织中总RNA后按照相关操作试剂盒进行cDNA合成，最后采用荧光定量PCR试剂盒在反应条件下进行PCR检测。相对表达水平采用2-ΔΔCt分析方法测定。各基因引物序列详见表1。

表1 基因引物方向(5′→3′)

9.Western blot法检测PU组织中相关蛋白表达情况：对各组大鼠PU创面组织蛋白进行提取后，参考于泽洋等[13]研究方法对Wnt1(抗体1∶1000)、β-catenin(抗体1∶1000)、GSK-3β(抗体1∶1000)和GAPDH(抗体1∶1000)蛋白表达情况进行检测，收集蛋白带后用凝胶成像分析系统分析相对光密度，用靶蛋白积分光密度(IOD)值/GAPDH(IOD)值显示靶蛋白相对水平[13]。

结 果

1.LBP对PU大鼠创面愈合的影响： 大鼠PU模型制备成功后给予LBP治疗，在第1天、3天、7天和14天时分别测量创面愈合情况，结果表明LBP组大鼠创面在3天、7天和14天时治愈率明显高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05),详见图1和图2。

图1 LBP治疗后不同时间点大鼠PU创面治愈率*P<0.05

图2 LBP治疗后不同时间点大鼠PU创面情况

2.LBP对PU大鼠创面组织学改变：PU大鼠创面组织损伤严重，产生了大量的炎性细胞浸润，成纤维细胞和毛细血管数目明显减少，给予LBP治疗后PU大鼠创面组织损伤得到了有效的修复，减轻了表皮炎性浸润增加了毛细血管数量，详见图3。

图3 各组大鼠皮肤HE染色病理结果(×400)A.空白组；B.模型组；C.LBP组

3.LBP对PU大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平的影响：PU大鼠血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平明显升高，给予LBP治疗后可以有效降低血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图4。

图4 LBP对PU大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平的影响A.TNF-α;B.IL-6;C.IL-1β。*P<0.05

4.LBP对PU大鼠血清SOD、MDA和VEGF表达水平的影响：与模型组比较，LBP对PU大鼠治疗后可以明显提高血清SOD表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)，同时LBP可以降低PU大鼠血清MDA表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。LBP治疗后与模型组比较，可以明显提高PU大鼠血清中VEGF表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图5。

图5 LBP对PU大鼠血清SOD、MDA和VEGF表达水平的影响A.SOD;B.MDA;C.VEGF。*P<0.05

5.LBP对PU大鼠组织中相关基因mRNA表达的影响：与模型组比较，LBP治疗后PU大鼠创面组织中Wnt1 mRNA和β-catenin mRNA表达明显升高，而GSK-3β mRNA表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图6。

图6 LBP对PU大鼠组织中相关基因mRNA表达水平的影响A.Wnt1 mRNA;B.β-catenin mRNA;C.GSK-3β mRNA。*P<0.05

6.LBP对PU大鼠组织中相关蛋白表达的影响：Western blot法结果表明，与模型组比较，LBP治疗后可以明显提高PU大鼠创面组织中Wnt1和β-catenin蛋白表达水平，降低GSK-3β蛋白表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图7。

图7 LBP对PU大鼠组织中相关蛋白表达水平的影响A.Western blot法检测结果；B.Wnt1/GAPDH;C.β-catenin/GAPDH;D.GSK-3β/GAPDH。*P<0.05

讨 论

PU又称为压力性溃疡，目前对其定义中明确提出了“三力学说”，即压力、剪切力和摩擦力，各因素可单独或复合存在作用。虽然PU的具体发病机制依然不清，但是目前主要认为其与皮肤缺血损伤、缺血再灌注损伤、代谢障碍和细胞变形等机制相关[2,14]。其中缺血再灌注损伤在PU的发生机制中得到了越来越多的关注，笔者前期研究与其他人研究都采用了缺血再灌注损伤方法进行模型制备，病理结果显示模型稳定可靠，为后续研究提供了保障[4,12, 13]。对于PU创面治疗中，损伤皮肤组织的治愈率是判断药物治疗成功的主要指标之一[12,13]。

本研究表明，给予LBP治疗后大鼠PU创面治愈率明显高于模型组。同时组织病理检测也表明，给予LBP治疗后创面得到了有效修复，减轻了表皮炎性浸润增加了毛细血管数量促进了创面的愈合。有研究表明，在PU形成过程中会产生大量炎性细胞因子，这些炎性细胞因子会破坏酶的活性降解细胞的基质和纤维连接蛋白，从而导致了创面的难愈合[15]。本研究表明，给予LBP治疗后可以有效降低血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平，通过降低机体炎性细胞因子水平从而促进了创面的愈合，研究与郑焱江等[16]研究结果相一致。有研究认为VEGF表示增高可以诱导微血管通透性增强，导致血浆蛋白广泛渗漏，直接或间接地改变细胞外主要成分，形成临时的新基质来支持内皮细胞和成纤维细胞的迁移，从而促进伤口愈合[17]。本研究给予LBP治疗后PU大鼠血清中VEGF表达水平明显增加，组织病理也表明更多的毛细管生成促进了创面的愈合。此外，在PU损伤中也会导致MDA表达水平升高和SOD表达降低，引起氧化应激损伤加重了皮肤组织损伤[18]。笔者研究表明，LBP治疗后可以有效提高血清中SOD表达水平，而降低MDA表达水平，表明LBP可以通过抑制氧化应激损伤达到治疗PU的作用，结果与肖洪玲等[19]研究结果相近。

在创面愈合中涉及多种调控因素和细胞信号通路，其中Wnt信号通路与创面修复密切相关[20]。研究表明，在皮肤发育过程中，Wnt信号通路是出现最早，也是皮肤损伤修复中最重要的信号通路。在毛发生长调节中Wnt信号通路也是必不可少，它可以促进毛裹生长，其中Wnt1是激活调控Wnt信号通路的关键蛋白[21]。此外，β-catenin也是Wnt信号通路中的关键蛋白，它可以进入细胞核内，从而导致靶基因CDK4等的表达，改变细胞周期[22]。而在皮肤损伤时，周围细胞释放的Wnt信号启动了β-catenin核转位，使其与Lef1/TCF等DNA结合蛋白形成转录复合物，启动Wnt靶基因转录和细胞的増殖分化过程，促进皮肤修复，而β-catenin蛋白表达降低会提高下游GSK-3β蛋白表达的增加使得皮肤自行修复能力下降，不利于创面的愈合[23]。

有研究表明，在PU的组织创面中，会出现β-catenin表达降低，而GSK-3β蛋白表达增加[24]。仇莲胤等[25]研究发现，黄芪提取液可以有效增加Wnt1和β-catenin表达，降低GSK-3β表达水平从而达到治疗糖尿病大鼠皮肤溃疡的作用。雷霆等[26]研究发现，三七/白芨胶海绵可以通过Wnt/β-catenin通路调控达到治疗皮肤溃疡的作用。此外，于泽洋等[13]研究也发现金鸡毛草提取物可以通过Wnt/β-catenin信号通路促进大鼠Ⅲ期压疮溃疡的愈合。本研究发现，LBP治疗后可以有效促进PU大鼠创面的愈合，通过增加Wnt/β-catenin信号通路中的关键调控蛋白Wnt1和β-catenin的表达水平，同时降低GSK-3β的表达水平，表明LBP可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路达从而到治疗PU大鼠创面的作用。