血清lncRNA-GAS5及miR-451在重症肺炎患儿中的表达水平及临床意义*

李 娜,王维娟,曾静霞

1.西北妇女儿童医院儿科急诊与PICU，陕西西安 710061;2.南京医科大学附属儿童医院重症医学科，江苏南京 210008

肺炎是儿童时期最为常见的呼吸道感染性疾病，是儿童死亡的重要原因。据流行病学调查结果显示，每年5岁以下发生肺炎的儿童约为5亿，其中有将近10%会发展成为重症肺炎[1-2]。在我国，每年患肺炎的儿童人数在2 000万以上，占住院总患儿数量的30%。儿童重症肺炎具有起病急、变化快、并发症多等特点，如果抢救不及时或诊治不当会使病情恶化，甚至造成患儿死亡。因此，对重症肺炎患儿的及时和正确的诊疗一直是儿科的重点关注方向。

长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度达200 nt的非编码RNA，近年来的研究发现，其在细胞生长、代谢及包括肺炎在内的多种人类疾病中起重要作用。lncRNA生长停滞特异性转录本5(lncRNA-GAS5)最初是从NIH3T3细胞中分离出来的，该基因已被发现可编码一种与淋巴瘤相关的染色体位点。已有研究证明，lncRNA-GAS5通过miR-455-5p/SOCS3途径促进肺炎患儿M1型巨噬细胞极化[3]。miR-451位于人类第11号染色体，是成熟红细胞中表达量最高的miRNA，其表达量会随红细胞的分化而增加[4]。已有研究表明，miR-451缺乏会导致红细胞发育障碍。另有证据显示，miR-451在肺的炎症性疾病的发生、发展过程中起重要作用，其异常表达可能成为诊断疾病的生物学标志物[5]。基于此，本研究拟探讨lncRNA-GAS5与miR-451在重症肺炎患儿中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月至2020年1月西北妇女儿童医院收治的89例重症肺炎患儿为研究组，其中男42例、女47例，平均年龄(4.13±1.34)岁。另选取同期在该院进行体检的健康儿童92例作为对照组，其中男43例、女49例，平均年龄(4.37±1.46)岁。两组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：(1)符合重症肺炎的诊断标准[6]；(2)患儿临床资料完整。排除标准：(1)有先天性心脏病、支气管肺发育不良等先天疾病的患儿；(2)有家族性遗传病的患儿；(3)既往有窒息病史的患儿；(4)合并有败血症等感染性疾病的患儿；(5)有意识障碍的患儿。本研究经西北妇女儿童医院伦理委员会批准，所有患儿家属均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1标本采集 所有受试者均于清晨空腹采集静脉血5 mL，以3 000 r/min离心15 min，分离血清进行相关指标检查或置于-80 ℃冰箱中保存待测。

1.2.2血清lncRNA-GAS5及miR-451水平的检测 通过Trizol 试剂(Invitrogen，日本)提取血清中的总RNA，并用分光光度计(Thermo Fisher Science，美国)测定RNA的浓度。根据制造商说明书，用PrimeScript RT Master Mix试剂盒(Takara，日本)将总RNA反转录成cDNA。用Takara SYBR Green PCR试剂盒(Takara，日本)进行实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)。反应体系(20.0 μL)：SYBR Green Master Mix 10.0 μL，cDNA模板(20 ng/μL)2.0 μL，上下游引物各2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。反应条件：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，共40个循环。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。本研究以U6为对照，采用2-ΔΔCt计算lncRNA-GAS5及miR-451的相对表达水平。试验所用引物序列如表1所示。

表1 试验所用引物序列

1.2.3血清载脂蛋白E(ApoE)、C-反应蛋白(CRP)及血清降钙素原(PCT)水平的检测 采用博科BK-400及其配套试剂(山东济南博科集团-博科生物有限公司)通过免疫比浊法检测血清ApoE及CRP的水平；采用免疫分析仪及其配套试剂(法国生物梅里埃公司)通过化学发光法检测血清PCT的水平。

2 结 果

2.1两组受试者血清lncRNA-GAS5及miR-451的表达水平 与对照组相比，研究组血清lncRNA-GAS5的表达水平明显降低，miR-451的表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组受试者血清lncRNA-GAS5及miR-451的表达水平

2.2两组受试者血清ApoE、CRP及PCT水平 与对照组相比，研究组血清ApoE、CRP及PCT的水平均明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组受试者血清ApoE、CRP及PCT水平

2.3研究组患儿血清lncRNA-GAS5、miR-451与ApoE、CRP、PCT的相关性分析 Pearson相关分析结果显示，血清lncRNA-GAS5表达水平与ApoE、CRP、PCT水平呈负相关(r=-0.493、-0.526、-0.477，P<0.05)；血清miR-451表达水平与ApoE、CRP、PCT水平呈正相关(r=0.547、0.446、0.454，P<0.05)。

2.4血清lncRNA-GAS5与miR-451对重症肺炎的诊断价值 通过ROC曲线分析血清lncRNA-GAS5、miR-451及二者联合诊断重症肺炎的效能，结果发现，血清lncRNA-GAS5、miR-451及二者联合检测诊断重症肺炎的曲线下面积(AUC)分别为0.869(95%CI：0.813～0.924)、0.966(95%CI：0.943～0.989)及0.979(95%CI：0.963～0.995)，联合检测的AUC大于单项检测。见表4和图1。

表4 血清lncRNA-GAS5及miR-451对重症肺炎患儿的诊断价值

图1 血清lncRNA-GAS5及miR-451诊断重症肺炎的ROC曲线

3 讨 论

肺炎虽然是一种在临床上较为常见的疾病，但其却具有潜在的危险性，若不能及时干预，有发展成重症肺炎的风险，严重时会引起全身炎症反应、多器官功能障碍、脓毒性休克，甚至威胁患者的生命安全。据统计，重症肺炎患者病死率高于30%，若抗感染治疗不及时，病死率将增加至60%[7]。因此，如何及时确诊并降低该病的病死率，是目前研究的重点。

已有研究证明，lncRNA在生物体生长、发育过程中扮演重要角色，其可通过转录水平、转录后水平及表观遗传学水平对靶基因的表达进行调控，参与多种疾病的发生、发展。近年来，lncRNA已成为多种疾病的重要诊断标志物。在肺炎方面，已有多项研究证明lncRNA可能是其关键的调控因子。CUI等[8]发现，lncRNA NEAT1可通过吸附miR-146b调节婴儿肺炎。CHEN等[9]则证明，lncRNA NNT-AS1、CRP和PCT在肺炎患者中均高表达，且lncRNA NNT-AS1与CRP、PCT的表达呈正相关，共同促进肺炎的发生。lncRNA-GAS5已被证明在多发性骨髓瘤、宫颈癌等癌症组织或血清中表达下调，并与患者预后相关[10-11]。WANG等[12]的研究证明，与健康人群相比，lncRNA-GAS5在肺炎患者血清中表达下调，其通过下调miR-155抑制脂多糖(LPS)诱导的人支气管上皮细胞凋亡。在本研究中，与健康儿童相比，重症肺炎患儿血清中lncRNA-GAS5表达明显降低，这与WANG等[12]的研究结果一致。另外，本研究通过相关性分析还发现lncRNA-GAS5与ApoE、CRP、PCT的表达呈负相关。

miRNA作为长度约为22个核苷酸的单链非编码RNA，也在生物体中参与转录后基因表达调控。FEI等[13]的研究发现，在肺炎患儿中，miR-3941表达下调，其可通过靶向IGF2调节PI3K/AKT通路的激活，促进LPS诱导的A549细胞损伤。孙旦等[14]研究显示，miR-492在支原体肺炎患儿血清中的水平较健康儿童明显升高，这说明其可能参与支原体肺炎的炎症反应。近年来的研究发现，miR-451可参与肿瘤、神经系统疾病及呼吸系统疾病的发生、发展[15-17]。有研究证明，miR-451 可能通过抑制Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB通路减缓哮喘气道炎症[18-19]。本研究发现，与健康儿童相比，重症肺炎患儿血清中miR-451的表达明显上调，且其与ApoE、PCT、CRP的表达呈正相关。

另外，本研究通过ROC曲线分析发现，lncRNA-GAS5诊断重症肺炎的灵敏度、特异度分别为84.3%、87.9%，AUC为0.869；miR-451诊断重症肺炎的灵敏度、特异度分别为93.3%、91.2%，AUC为0.966。这一结果说明单项检测时miR-451对于重症肺炎的诊断效能高于lncRNA-GAS5。对lncRNA-GAS5和miR-451进行联合检测，其灵敏度、特异度分别为86.1%、92.1%，AUC为0.979。这一结果说明二者联合检测诊断重症肺炎时的诊断效能高于lncRNA-GAS5、miR-451单项检测。

综上所述，lncRNA-GAS5和miR-451均有可能成为重症肺炎的早期诊断标志物，且二者联合检测的诊断效能高于单项检测。但本研究是单中心、小样本量研究，结果具有一定的局限性，因此还需要更大样本量的研究来验证上述结果。