1例新型FGA基因纯合突变导致的遗传性纤维蛋白缺陷症家系分析*

杨 敏，钟硕贤，林荣万，蒙火凤，谭会柳，谭碧玉，陈淑琴，刘焕亮，3，郑 丽△

1.中山大学附属第六医院临床检验科，广东广州 510655；2.中山大学附属第六医院妇科，广东广州 510655；3.广东省胃肠病学研究所，广东广州 510655

纤维蛋白原(FIB)是一个由Aα链，Bβ链和γ链3对多肽链组成的，由29个链间二硫键连接而成的相对分子质量为340×103的糖蛋白。3条肽链分别由FIB α链(FGA)、FIBβ链(FGB)和FIBγ链(FGG)3个同源基因编码[1]。遗传性FIB缺陷症(CFD)主要分为Ⅰ型和Ⅱ型两种类型，Ⅰ型为FIB数量减少，包括低纤维蛋白血症和无纤维蛋白血症；Ⅱ型则为患者血浆中FIB数量正常或减少，但活性水平不成比例的显著降低，包括异常纤维蛋白血症和低-异常纤维蛋白血症[2]。CFD是一种罕见的染色体隐性遗传疾病，主要是由于FIB基因突变导致FIB数量或结构异常造成的。临床症状呈现多样性，包括无症状、出血、血栓形成，或出血表现和血栓形成同时存在。本研究发现了1例CFD，经患者及其家属之情同意后，对此患者及其家属的表型和基因型进行了家系研究，初步探讨其发病机制，为该病的研究提供临床依据。

1 资料与方法

1.1家系资料 先证者，女，45岁，15年前剖宫产曾出现大出血，进行输血治疗，此次因“宫腔肿物”需行宫腔镜手术，术前查凝血功能，发现凝血功能异常。自述无自发性出血、鼻衄等症状，否认高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病等慢性疾病史。该家系共3代5人，遗传家系图谱见图1。

图1 先证者的家系图

1.2试剂与仪器 日本希森美康XN-2000全自动血液分析仪(血常规试剂为原厂配套试剂)，美国沃芬ACL TOP血凝分析仪(凝血相关项目试剂为原厂配套试剂)，美国贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪(肝功能检测试剂为原厂配套试剂)，基因组DNA提取试剂盒(Qiagen，德国)，Illumina Novaseq 6000 测序仪(Illumina，美国)。

1.3方法

1.3.1血常规检测及肝功能检测 用希森美康XN-2000全自动血液分析仪及其配套试剂对乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝静脉血标本进行血常规检测，用贝克曼库尔特AU5800全自动生化分析仪及其配套试剂进行肝功能检测。

1.3.2血栓与止血实验室检测 将枸橼酸钠抗凝血标本进行离心(3 000 r/min，10 min)，然后取上层血浆，用沃芬ACL TOP血凝分析仪及其配套试剂进行凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、FIB(Clauss法)和D-二聚体(D-D)检测。同时，将枸橼酸钠抗凝血标本进行血栓弹力图检测。

1.3.3基因检测 使用DNA提取试剂盒提取先证者及其家属的外周血白细胞基因组DNA，然后通过超声破碎并纯化以产生200～300 bp的DNA片段，末端标记双脱氧法在Illumina Novaseq 6000 测序仪上进行正向和反向测序。

2 结 果

2.1血液系列检查结果 先证者与家系成员血常规和肝功能检测均未见异常，故排除因肝脏疾病等引起的FIB缺陷。先证者PT、TT均明显延长，FIB水平显著降低，其父亲、母亲和女儿TT均轻度延长，FIB轻微降低，其他均在正常范围(表1)。先证者血栓弹力图检测中FIB功能参数K值和Angel角结果正常，说明FIB活性正常。

表1 先证者及其家属的凝血指标、血常规和肝功能结果

2.2基因检测结果 经FGA、FGB和FGG基因外显子和毗邻内含子区域进行PCR扩增和高通量测序后发现，先证者的FGA基因第5号外显子的c.1390A存在碱基重复突变，且为纯合变异，其父母和女儿则携带该位点杂合变异(图2)。通过gnomAD数据库对该位点进行查询，未发现该位点突变的数据，排除基因多态性可能。

注：A为先证者的FGA基因序列；B为先证者母亲的FGA基因序列；箭头表示c.1390Adup突变。图2 测序峰图

3 讨 论

位于4号染色体上的FGA、FGB和FGG基因，分别编码Aα链、Bβ链和γ链3条肽链，然后形成Aα-Bβ-γ多肽链，两条多肽链通过二硫键结合形成一个对称型六聚体复合物，其外部包含两个D结构域和一个中央的E结构域，即为FIB[3]。FIB由肝细胞分泌释放进入血液，主要通过两种方式在外周血中发挥凝血和止血功能。首先，FIB与血小板表面的膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体结合，从而促进血小板的活化与聚集[4]。其次，FIB还在凝血酶的作用下，裂解出纤维蛋白多肽，转变成纤维蛋白单体，然后在凝血因子a和Ca2+的作用下，通过共价键形成稳定的纤维蛋白多聚体，从而发挥止血功能[5]。由于编码基因的突变导致FIB分子结构和(或)功能异常，从而引起FIB释放异常，FIB单体聚合异常，FIB单体交联异常和纤维蛋白凝块纤溶异常等，因此引发CFD。

本家系中，先证者APTT、D-D和血栓弹力图检测均正常，PT和TT明显延长，FIB显著降低，初步诊断为CFD，其父母及女儿的TT轻度延长，FIB轻微降低。家系成员基因测序是诊断CFD的金标准，因此对先证者及其父母和女儿进行了基因测序。研究结果发现先证者存在FGA基因第5号外显子的c.1390Adup的纯合突变，从而导致该基因编码的第464位氨基酸发生移码突变，导致苏氨酸(Thr)变为天冬氨酸(Asp)，在移码突变3个氨基酸后，翻译随即中止。其父母和女儿则携带该位点杂合变异，其父母为非近亲结婚，均符合孟德尔遗传定律。由于本研究目的为确定是否为CFD，故未做FIB抗原检测，未对先证者进行CFD的进一步分型。1958年发现第1例CFD患者和1968年发现第一个突变位点，之后陆续有大量的研究报道了不同的致病突变位点，不仅涉及FGA、FGB和FGG3个基因的外显子，还涉及其旁侧的内含子区域，通过影响转录、mRNA剪切、翻译、肽链折叠和组装等一系列过程导致FIB出现分子结构和(或)功能异常，从而导致疾病发生[6]。ASSELTA等[7]报道，一些突变虽然使转录提前终止，产生了严重截短的α链，从而逃脱了无义突变介导的mRNA降解，但是却最终导致了FIB六聚体分子分泌障碍。ATTANASIO等[8]发现IVS3+1_+4delGTAA能够导致3号外显子跳跃，最终破坏编码框，导致转录提前终止。本研究先证者因一个碱基对的重复，产生移码突变，从而导致框外转录产物和终止密码子提前，该变异可能会引起蛋白质截断或者激活无义介导的mRNA降解，从而导致FGA基因的蛋白质产物功能丧失。查阅文献显示，该突变类型为国际尚未报道的新突变，未在文献中报道，但是有研究表明该变异的下游截断变异为致病性变异[9]。

研究发现约55%的CFD患者无任何临床症状，约25%的CFD患者主要临床表现为出血，包括脐带出血、中枢神经系统出血、肌肉血肿、关节出血、牙龈出血、鼻衄等，约20%的CFD患者有血栓倾向且主要为静脉血栓[10]。本研究中的先证者自述无自发性出血、鼻衄等症状，曾因剖宫产引发大出血。其父母均无症状，女儿自12岁首次月经开始至今存在月经量大、经期过长的症状。由于该疾病较为少见，且因检测手段有限，极易被漏诊，误诊，而这类患者随着病程进展或经历外伤、手术分娩等，有严重出血或血栓形成甚至危及生命。因此临床医生应通过临床表现、凝血相关检查及基因遗传学检查综合诊断。

通过以上分析可以推断，c.1390Adup的纯合突变是导致先证者患CFD的原因，且其父母及女儿均为该位点的杂合突变，故表现为TT轻度延长，FIB轻微降低。因此笔者认为，通过凝血相关检查结合基因测序能够对CFD进行确诊。希望随着分子遗传学的不断发展，同时通过更多病例及其突变位点的报道和收集，更好地揭示基因型和表型的关系，对CFD的致病分子机制了解越来越深入。