枸杞黄酮的提取及其促进伤口愈合潜力的探究

翟志毫，李长恩，赵中楠，王先柱，王译泽，王颖*

新疆大学纺织与服装学院（乌鲁木齐 830017）

皮肤作为人体最大的器官，具有许多重要的功能，如感知环境、调节体温、提供被动和主动防御等[1-2]。然而，当皮肤损伤程度超过其自身修复能力时，通常需要借助外源干预，如包扎、贴敷特效药等方式促进伤口愈合。伤口的愈合过程主要包括凝血、炎症、增殖和重塑4个阶段[3]，愈合过程中任何阶段的失调都有可能延缓伤口愈合，使伤口恶化，甚至变为慢性伤口，增加患者痛苦，并使后期发病率和治疗成本不断提高[4]。研究发现，全球1%～2%的人正经受慢性伤口的折磨，每年治疗这类伤口的花费超过250亿美元[5-6]。因此，寻找并开发促进伤口促愈合的药物至关重要。

近年来，天然药物的研究与开发受到国内外普遍关注。长期以来，枸杞作为传统的药物和功能性食材，被广泛种植于青海、宁夏、新疆等地区[7]。大量研究表明枸杞中富含黄酮类、酰胺、生物碱、蒽醌等多种活性成分[8-10]，其中的黄酮类化合物具有促进伤口愈合的活性，并且可以在伤口涵盖愈合的4个阶段均发挥作用，如增加胶原蛋白沉积、抵抗氧化应激的产生、调节炎症细胞因子、提高上皮化率和伤口收缩率、促进细胞增殖和血管生成[11-15]。此外Wang等[16]的研究表明，枸杞提取物还能促进神经细胞增殖和神经元分化。因此，枸杞提取物在治疗皮肤损伤等方面具有很大潜力。然而，国内对枸杞提取物的研究主要集中于地区性黄酮含量差异的比较研究、提取工艺的优化、黄酮的分离及纯化等方面[17-19]，对于枸杞提取物作为潜在医用敷料负载活性物质的研究还较少。

因此，试验采用乙醇等溶剂对新疆精河县红果枸杞中的黄酮类物质进行热回流提取。通过DPPH自由基清除试验、抗菌试验评价枸杞提取物的体外抗氧化和抑菌性能，并通过小鼠成纤维细胞（L929）分析枸杞提取物的体外细胞毒性，以期为枸杞作为天然药用植物资源在伤口愈合等生物医用材料领域的开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红果枸杞（购自中国新疆精河县）；无水乙醇、石油醚、氯化钠、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝（AR，国药集团化学试剂有限公司）；芦丁、2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）、抗坏血酸（VC，AR，上海源叶生物技术有限公司）；大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）：南通凯恒生物技术有限公司；4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，北京索莱宝科技有限公司）；碘化丙啶（PI，北京索莱宝科技有限公司）；CCK-8试剂盒、小鼠成纤维细胞（L929）：武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 枸杞黄酮提取单因素试验

利用单因素试验制备枸杞提取物。将清洁干燥后的枸杞粉碎并过0.425 mm孔径（40目）筛。称取50 g枸杞粉末，按照不同料液比（1∶7，1∶8，1∶9和1∶10 g/mL）浸泡于乙醇溶液（60%，70%，80%和90%）中，分别于50，60，70和80 ℃浸泡50，70，90和110 min。重复浸泡3次后，收集浸泡液并过滤，旋转蒸发获得枸杞提取物浸膏。

1.2.2 枸杞黄酮含量的测定

制作芦丁标准曲线，并测定枸杞中的黄酮含量[20]。拟合成线性方程：y=9.114 29x+0.007 14（R2=0.993 86），根据式（1）计算枸杞黄酮含量。

W=（V×N×C）/m（1）式中：W为枸杞黄酮含量，mg/g；V为测试吸光度溶液的定容体积，mL；N为醇提物溶液总体积与测吸光度部分体积之比；C为由标准曲线计算得到定容液的芦丁溶液浓度，mg/mL；m为所用粉末总质量，g。

1.2.3 枸杞提取物的抗氧化性能测试

制备0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。分别取2 mL不同浓度的枸杞溶液（0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mg/mL），与2 mL DPPH溶液混合，避光保存30 min。以相同浓度的VC溶液作为阳性对照，在517 nm处测量各组的吸光度。DPPH自由基清除率SR（%）按式（2）计算。

式中：Ai为待测液加入2 mL DPPH后，517 nm处的吸光度；Aj为待测液加入2 mL无水乙醇后，517 nm处的吸光度；Ac为DPPH溶液和无水乙醇的混合液在517 nm的吸光度。

1.2.4 枸杞提取物的抑菌性能测试

利用凝胶扩散试验检测枸杞提取物对E.coli和S.aureus的抑菌活性。分别取100 μL菌液（106～108CFU/mL）涂布于平板上。将浸泡过不同浓度的枸杞提取物的滤纸片（d=8 mm）放置于平皿中，于37 ℃培养16～24 h后测量滤纸片的抑菌圈直径。

1.2.5 荧光染色法探究枸杞提取物对菌膜的作用机制

利用荧光染色法初步探究枸杞提取物的抑菌机制。将对数生长期的E.coli和S.aureus分别与枸杞提取物（1 g/mL）于37 ℃孵育12 h。PBS洗涤菌体后，加入100 μL的DAPI和PI混合液（35 μg/mL），避光染色15 min。利用PBS洗涤菌体，去除多余染料后于倒置荧光显微镜下观察细菌。

1.2.6 SEM观察枸杞提取物对菌体形态影响

利用SEM观察细菌与枸杞提取物孵育后的形态。将处于对数生长期的E.coli和S.aureus分别与枸杞提取物（1 g/mL）于37 ℃孵育12 h。PBS洗涤菌体后，加入2.5%戊二醛溶液于4 ℃固定过夜。利用梯度浓度的乙醇脱水，每次脱水时间15 min。利用SEM观察细菌形貌。

1.2.7 枸杞提取物的细胞毒性测试

利用CCK-8试验检测枸杞提取物对L929小鼠成纤维细胞的细胞毒性。将L929细胞浓度调整为1×106个/mL，取100 μL接种于96孔板中，分别加入不同浓度的枸杞提取物溶液，使其终浓度分别为2.5%，5.0%，7.5%和10.0%，培养24和48 h。每孔添加10 μL CCK-8溶液，继续孵育4 h，于450 nm测量吸光度。

1.2.8 数据统计分析

每组数据至少重复3次，并以平均值±标准差（mean±SD）表示，采用Origin 2022b和Graphpad Prism 5软件进行数据图像处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

枸杞中的黄酮类化合物是抑菌、抗氧化的主要成分，为提高枸杞黄酮的提取效率，利用单因素试验检测提取温度、乙醇体积分数、料液比以及浸泡时间对提取物中黄酮含量的影响。如图1（A）所示，黄酮含量随水浴温度的提高而呈现先增加后降低趋势。温度70 ℃时黄酮含量达到最大，为15.13 mg/g，这可能是由于黄酮类化合物在较高温度下的溶解度增加，但温度过高黄酮类化合物结构被破坏。因此，提取温度在70 ℃较为适宜。

植物中有效成分的提取率也与溶剂有关，试验利用不同体积分数乙醇（图1B）提取枸杞中的黄酮，乙醇体积分数80%时，提取物中黄酮含量最高，为15.52 mg/g。

此外，检测不同料液比（图1C）对提取物中黄酮含量的影响发现，料液比从1∶7（g/mL）增加到1∶8（g/mL）时黄酮含量增加，而继续增加料液比，提取物中黄酮含量变化不明显，因此制备枸杞提取物的最佳料液比为1∶8（g/mL）。检测不同提取时间（图1D）对枸杞提取物中黄酮含量的影响。结果显示，黄酮含量随着时间的增加呈现先增加后下降趋势，提取时间90 min时，枸杞提取物中的黄酮含量最高，因此提取时间设定为90 min。

根据单因素试验结果确定，制备枸杞提取物的最佳条件是水浴温度70 ℃、乙醇体积分数80%、料液比1∶8（g/mL）、提取时间90 min。在此条件下获得的枸杞提取物中的黄酮含量为15.52 mg/g。

2.2 提取物抗氧化活性分析

反复发作的炎症，会延迟伤口的愈合，而炎症与自由基有关，清除过量的自由基可以减少炎症的发生，促进伤口愈合[21]。因此，通过DPPD清除法评价枸杞提取物的体外抗氧化活性。如图2所示，枸杞提取物浓度0.5 mg/mL时，DPPH自由基清除率为22.97%，且与其浓度呈正相关关系，最高可达81.4%，接近同等浓度下VC溶液（85.59%）。枸杞提取物良好的抗氧化活性主要来源于枸杞中的黄酮类化合物，此外提取物中还含有大量多糖、生物碱等活性物质，对DPPH自由基也存在不同程度的清除作用[22-23]。

图2 枸杞提取物的抗氧化活性

2.3 提取物的抑菌性能分析

细菌感染是延迟伤口愈合的另一个主要原因，因此通过凝胶扩散试验评价枸杞提取物的体外抑菌活性。各浓度下的抑菌效果如图3所示。枸杞提取物浓度1 g/mL时对E.coli和S.aureus的抑菌圈直径分别为11.0和11.5 mm，具有较好的抑菌效果。这可能是由于枸杞提取物中含有大量的黄酮类化合物，而这类化合物能够破坏细菌膜的结构并抑制核酸合成，从而达到抑制细菌生长的作用[24]。但是随着枸杞提取物浓度的降低，抑菌圈逐渐减小，枸杞提取物的浓度低于0.2 g/mL与0.1 g/mL时，分别对E.coli和S.aureus无抑菌性。可能是因为低浓度的提取物未能对细菌膜造成有效破坏，从而无法抑制细菌生长。

图3 枸杞提取物抑菌性能

2.4 荧光染色法检探究枸杞提取物对菌膜的作用机制

为分析枸杞提取物的抑菌机制，利用DAPI和PI这2种荧光染料对与枸杞提取物共孵育后的细菌细胞膜的完整性进行检测[25]。如图4所示：由于DAPI可以穿透细菌细胞膜，因此所有的细菌在荧光显微镜下均显示蓝色；在菌体细胞膜完整的情况下，PI染料却无法进入细胞对细胞核进行染色，所以在荧光显微镜下观察不到荧光；与枸杞提取物共孵育后的细菌在荧光显微镜下可看到明显的红色，说明枸杞提取物可能是通过破坏细菌细胞膜的完整性从而具有抑菌性能。

图4 细菌荧光图

2.5 SEM观察枸杞提取物对菌体形态影响

利用SEM观察枸杞提取物对菌体形貌的改变。如图5所示，正常的菌体E.coli和S.aureus具有清晰的轮廓和完整的形态，且细菌表面光滑。而与枸杞提取物共孵育的细菌，菌体出现凹坑和破裂，甚至细胞内物质外泄的现象，细胞无法保持正常的细胞形态。因此，可以确定枸杞提取物能够破坏细菌的细胞膜，从而杀死细菌。

图5 细菌SEM图

2.6 枸杞提取物的细胞毒性评价

理想的伤口敷料不仅需要具有一定的抑菌、抗氧化能力，还应该能够促进伤口愈合。因此，用不同浓度（2.5%，5.0%，7.5%和10.0%）的枸杞提取物与小鼠成纤维细胞（L929细胞）共培养，并在24和48 h检测细胞活性，结果如图6所示。在24和48 h所有试验组的吸光度均大于空白对照组，根据细胞增殖率公式，按式（3）计算，得出各组的细胞增殖率均大100%[26]。因此，可以判定各试验组对L929细胞无细胞毒性，并在一定程度促进细胞增殖。因此，枸杞提取物可以作为一种促进伤口愈合的潜在生物活性物质。

图6 枸杞黄酮提取物对L929细胞的细胞毒性

RGR=试验组吸光度/对照组吸光度×100% （3）

3 结论

由于富含黄酮等多种生物活性物质及其广泛的药理作用，新疆枸杞在皮肤伤口愈合方面具有较大应用潜力。以新疆枸杞为研究对象，通过单因素法、DPPH法、抑菌试验、CCK-8法、荧光染色试验等方法进行枸杞提取工艺的分析及其伤口愈合活性的评价，以探讨负载枸杞提取物的伤口敷料用于治疗皮肤伤口愈合的潜力。

结果表明：在水浴温度70 ℃、乙醇体积分数80%、料液比1∶8（g/mL）、静置时间90 min的提取条件下，所提取的枸杞黄酮含量最高，为15.52 mg/g，而且提取工艺简单，成本低、效率高；所提取的活性物质可有效发挥抑菌、抗氧化等作用，且有浓度效应，对典型菌种如大肠杆菌、金黄色葡萄球的最低抑菌浓度分别为0.2和0.1 g/mL，而且浓度2.5 mg/mL时其DPPH自由基清除力与同浓度的抗坏血酸相当；枸杞提取物可通过与细菌细胞膜相结合并破坏膜结构的机制使细菌失活，从而达到抑菌、杀菌的效果。此外，枸杞提取物无细胞毒性，并能促进L929细胞增殖，从而有利于皮肤伤口愈合。因此，枸杞提取物具有的生物活性特征，可作为治疗皮肤伤口材料的有效负载物。