红曲霉固态发酵青稞酒工艺优化研究

何冰桃，党 斌，2，郑万财，2，张文刚，2，张 杰，2，杨希娟，2

（1. 青海大学农林科学院，青海省青藏高原农产品加工重点实验室，青海西宁 810016；2. 青藏高原种质资源研究与利用实验室，青海 西宁 810016）

青稞，又称裸大麦，是青藏高原地区主要粮食作物，具有“三高两低”的营养特点[1]。青稞还含有β - 葡聚糖、γ - 氨基丁酸、多酚等多种具有独特生理功效的成分，可有效预防糖尿病、高血压等多种疾病[2-3]。青稞不仅是制曲、酿造啤酒、粮食加工制品的主要原料，其还可制造药品、糖化剂、饴糖等，对牲畜也是很好的精饲料。青稞的营养健康作用已被证实，青稞产业快速发展，产品类型越来越丰富，备受消费者青睐，青稞正在由一个区域性口粮作物转向健康食源作物发展[4-5]。

青稞酿酒的历史悠久，青稞除了可酿制蒸馏白酒，还可制作青稞发酵酒。目前，市面上青稞酒主要分为非蒸馏型的青稞咂酒，蒸馏型的青稞烤酒和青稞白酒，以青稞、大麦为原料的青稞啤酒、青稞清酒及调配青稞酒等[6]。相较于高浓度的青稞白酒，青稞黄酒的酒精度偏低，一般为8～15%Vol，香醇而不烈，老少皆宜，且保留了青稞丰富的营养成分，具有更加广阔的市场，但是市面上的青稞黄酒多以根霉菌、黄酒酵母作为发酵剂，青稞中的多酚成分也大多损失，并没有在青稞酒中较好地保留下来。

红曲霉中含有包括糖化酶、酸性蛋白酶、酯化酶等各种酶类，在发酵过程中能代谢产生γ - 氨基丁酸、红曲色素、洛伐他汀等多种活性物质[7-8]。有研究表明，红曲霉产生的水解酶可以破坏细胞壁结构，断裂酚类物质与其他物质相互作用的化学键，促进植物基质或者谷类食品多酚类活性成分的释放，并且在大豆、燕麦、薏米、大麦等谷物的研究中已有相关报道[9-12]，也有研究证明了红曲霉发酵能够有效提高酒体的多酚含量和抗氧化活性[13-14]，但是将红曲霉菌应用于发酵高原特色的青稞酒的相关研究未见报道，因此进行红曲霉固态发酵青稞酒工艺研究对丰富青稞发酵产品、推动青稞产业发展具有重要意义。以青稞为原料，对青稞籽粒进行前处理，通过红曲霉固态发酵青稞酒，以多酚质量浓度、黄酮质量浓度、酒精度和感官评分作为主要评价指标，优化富含酚类物质的红曲青稞酒发酵的工艺参数，并对其抗氧化活性进行研究，为青稞低度酒的开发及产业化提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

ACCC 30352 紫红曲霉，上海瑞楚生物科技有限公司菌种保藏中心（RCCC） 提供；昆仑20 号青稞、昆仑15 号青稞米，青海省农林科学院作物所提供；安琪甜酒曲，湖北安琪酵母股份有限公司提供；食用柠檬酸，潍坊英轩实业有限公司提供；食用小苏打，山东圣琪生物有限公司提供。

1.2 试验设备

SX-500 型蒸汽灭菌器，日本TOMY KOGYO 公司产品；SW-CJ-2FD 型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司产品；THZ-98AB 型恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司产品；LRH-150 型生化培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司产品；FW 100 型高速万能粉碎机，上海科恒实业发展有限公司产品；DL-5M 型低速冷冻离心机，湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司产品；SHB-III 型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司产品；R-210 型旋转蒸发仪，瑞士BUCHI 公司产品；N4S 型紫外线可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司产品；SGD- IV型全自动还原糖测定仪，中国辽宁塞亚斯科技有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 青稞红曲米制作工艺流程

（1） 麦芽汁琼脂固体培养基配方。麦芽汁培养基质量浓度131.0 g/L，琼脂粉质量浓度15 g/L。

（2） 种子液配方。葡萄糖用量6.0 g，蛋白胨用量0.5 g，磷酸二氢钾用量0.25 g，硝酸钠用量0.3 g，硫酸镁用量0.1 g，蒸馏水用量100 mL。

（3） 菌悬液。自培养平板中勾取5 环菌丝接入50 mL 无菌生理盐水中，于28 ℃下以转速180 r/min恒温振荡1.5 h。

（4） 种子液。将100 mL 种子液装于250 mL 锥形瓶中，于121 ℃下高压灭菌20 min，冷却至室温后，用移液枪（使用高压蒸汽灭菌的枪头） 取5 mL菌悬液，移入种子液培养基中，于28 ℃下以转速180 r/min 恒温振荡培养63 h，即得种子液，用于接种发酵培养基。

1.3.2 红曲霉固态发酵青稞酒工艺流程

（1） 预处理方式的筛选。①不同脱皮层数青稞原料的筛选。分别取50 g 未脱皮、脱皮1 次、脱皮2 次、脱皮3 次、脱皮4 次的昆仑15 号青稞米作为原料，洗净后以3 倍质量的蒸馏水浸泡12 h，洗净沥水后，加入1.2 倍蒸馏水，封口膜封口后于121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min，待冷却后拌入10%红曲粉和1%安琪甜酒曲共同发酵，25 ℃下发酵1 d 后转入28 ℃发酵。5 d 后取发酵液测定还原糖含量，筛选出最优脱皮层数。②不同红曲米处理方式的筛选。粉曲处理，称量5 g 青稞红曲米用万能粉碎机粉碎15 s，间歇5 s，重复粉碎3 遍。浸曲处理，称量5 g 青稞红曲米至三角瓶中，加入无菌温水20 mL，搅匀，28 ℃下保温浸泡12 h，此时青稞红曲多数浮起，表面有小气泡（发酵现象），略有轻微酒气。采用加曲发酵前12 h 预浸红曲，有利于红曲中酶类物质大量溶出，加速液化，提高糖化速度。以筛选出的青稞米作为发酵基物，分别加入粉曲处理和浸曲处理的红曲作为发酵剂，进行发酵，并通过测定前发酵过程中液体发酵物中的还原糖含量筛选出最优的原料处理方式。

（2） 红曲霉固态发酵青稞酒工艺优化。在传统半干型黄酒酿造工艺的基础上，设计单因素试验，以感官评定、酒精度、氨基酸态氮及多酚、黄酮类物质为指标，确定红曲霉固态发酵青稞酒的料液比、加曲量、初始发酵pH 值、发酵温度及发酵时间等工艺条件。进行单因素试验和正交试验，优化酿造条件。①单因素试验设计。以每个单因素试验的最优结果进行下一单因素试验。②正交试验设计。在单因素试验基础上，设计四因素三水平正交试验L9（34）工艺条件。

单因素试验设计见表1，正交试验因素与水平设计见表2。

表1 单因素试验设计

表2 正交试验因素与水平设计

1.3.3 青稞红曲酒质量评价

（1） 感官品质评价标准。感官品质评价在品酒室中进行，品酒室要求光线充足、柔和、适宜，温度20～25 ℃，空气新鲜，无香气及邪杂气味。感官评定参考GB/T 13662—2018《黄酒》中传统型半干黄酒的感官要求。

青稞红曲酒感官要求见表3。

表3 青稞红曲酒感官要求

（2） 酒精度、总酸、氨基酸态氮、还原糖、总糖等理化指标的测定参照GB/T 13662—2018《黄酒》。

（3） 总黄酮含量的测定。参考黄丹丹等人[15]的测定方法，绘制芦丁标准曲线，得到线性回归方程：Y=0.007 7X-0.051 9，R2=0.998。①样品的制备。移取1 mL 酒液至10 mL 容量瓶中，以浓度为0.1 mol/L的NaOH 溶液调pH 值至中性，再多加2 滴，水定容至刻度，摇匀，备用。②样液测定。取2 mL 样液4 等份，置于10 mL 具塞试管中，加入质量分数为5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，静置6 min，加入质量分数为0.3 mL 10%硝酸铝溶液（以不加硝酸铝作为空白），静置 6 min，加入质量分数为4%的氢氧化钠溶液2 mL，混匀后，以体积分数30%的乙醇定容，放置15 min 后测定波长510 nm 处吸光度。

（4） 总酚含量的测定。参考黄丹丹等人[15]的测定方法，绘制没食子酸标准曲线，得到线性回归方程：Y=0.016 4X-0.038 4，R2=0.998。样液测定：试验组加酒液0.05 mL，去离子水4.95 mL，以水作空白，分别加入福林酚0.5 mL，充分摇匀后加入7.5%碳酸钠溶液1 mL，于45 ℃下反应15 min，于波长765 nm处测吸光度，平行测定3 次。

（5） 抗氧化指标测定。参考杨希娟等人[16]的方法。①清除DPPH·自由基活性测定。吸取酒液50 μL于试管中，再加入浓度为0.1 mmol/L 的DPPH·甲醇溶液4.5 mL，充分摇匀后避光反应30 min，以无水甲醇代替提取液作空白调零，于波长517 nm 处测定吸光度，平行测定3 次。②清除ABTS 自由基活性测定。吸取酒液20 μL 于试管中，再加入ABTS 自由基工作液4 mL，充分摇匀后避光反应30 min，以无水甲醇代替提取液作空白调零，于波长734 nm 处测定吸光度，平行测定3 次。③FRAP 铁还原能力测定。吸取酒液50 μL 于试管中，再加入FRAP 工作液4.5 mL，充分摇匀后避光反应30 min，以无水甲醇代替提取液作空白调零，于波长593 nm 处测定吸光度，平行测定3 次。

1.4 数据分析

所有的试验数据都是3 次试验的平均值，应用Excel 和SPSS-26 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 预处理方式筛选结果

2.1.1 不同脱皮层数青稞原料的筛选

脱皮层数对前发酵还原糖含量的影响见图1。

图1 脱皮层数对前发酵还原糖含量的影响

由图1 可知，随着脱皮层数的增多，红曲霉发酵青稞产生的还原糖呈现先增多后减少的趋势。脱皮3 次的青稞经发酵后还原糖含量最高为6.21%。这可能是由于脱皮去除了部分青稞坚硬的颖壳，使得红曲霉菌及根霉菌可充分与青稞胚乳接触，生长繁殖并分泌水解酶系，将淀粉和纤维素等大分子物质分解为可供微生物生长的葡萄糖[16-17]，促进微生物的快速生长和发酵，由此产生的正反馈系统为后期酒精发酵提供了充足的碳源反应物。当青稞米进行4 次脱皮处理时，发酵前期产生的还原糖含量下降，这可能与青稞的过度碾磨、糊粉层和亚糊粉层被完全剥离、胚乳层的淀粉颗粒受到磨损有关。

2.1.2 不同红曲米处理方式的筛选

红曲米预处理方式对前发酵还原糖含量的影响见图2。

图2 红曲米预处理方式对前发酵还原糖含量的影响

由图2 可知，粉曲处理组红曲霉发酵青稞产生的还原糖质量浓度要显著高于浸曲处理组（p＜0.05）。相较于浸曲处理，粉碎处理使红曲与青稞物料混合更加均匀，红曲霉能够充分依附在青稞表层，迅速地向内生长繁殖，分解胚乳中的淀粉组织，释放出还原糖。而且，在实际生产过程中，浸曲处理在投入生产时不便控制，极易引发杂菌侵染，不如粉曲使用时便捷可控，因此以粉碎处理的红曲作为发酵剂更加有利于后期的酒精发酵。

2.2 红曲霉固态发酵青稞酒工艺优化

2.2.1 料液比对红曲霉发酵青稞酒的影响

料液比对青稞酒品质的影响见图3。

图3 料液比对青稞酒品质的影响

由图3 可知，随着料液比变小，发酵后青稞酒中的多酚、黄酮质量浓度和酒精度呈现出先增大后减小的趋势，在料液比为1∶1.5（g∶mL） 时达到最高，而酒体的感官评分随着料液比的增大持续降低。这可能是因为较高的料液比使发酵液中总糖含量偏高，青稞酒滋味更加香醇；加水量少和粉曲处理形成的高渗环境抑制了红曲霉菌和根霉菌的生长繁殖，发酵不充分，酒精度偏低，青稞中的多酚和黄酮成分也难以释放；而随着料液比降低，蒸熟后青稞的黏性增强，高黏环境使青稞基料中透氧量大幅下降，红曲霉和根霉生长受阻，发酵后期更容易受到杂菌侵染，成品酒发酸发涩，感官品质变差。因此，综合考虑酒精度、感官指标和功能性多酚类物质的质量浓度，确定最佳料液比为1∶1.2（g∶mL）。

2.2.2 加曲量对红曲霉发酵青稞酒的影响

加曲量对青稞酒品质的影响见图4。

由图4 可知，随着加曲量增大，青稞酒的酒精度和感官评分先增大后趋于平缓，总酚质量浓度先增大后减小，黄酮质量浓度略有减少。加曲量对青稞酒的影响是直观可视的，随着加曲量的增加，青稞酒越发红润透亮，感官评分增大；当加曲量较低时，红曲霉产生的蛋白酶无法充分分解青稞中的蛋白质，发酵前蛋白质大量残留，促使发酵时细菌过度繁殖产酸[18-19]，青稞酒口感酸涩；但加曲量过高，红曲霉大量生长抑制了根霉菌的活性，2 种菌的协同发酵效果变差，红曲特征过于浓厚，会使青稞酒口感发涩，损害青稞酒的整体协调性；且红曲霉的过度生长，会导致后发酵底物不足，加速酸类物质积累，抑制多酚类物质的产生。当加曲量为15%时，酒体中总酚质量浓度最高为1 457.20 mg/L，此时青稞酒色泽明丽气味芳香，酒体的酒精度最高，感官评分达69.11 分。

2.2.3 初始发酵pH 值对红曲霉发酵青稞酒的影响

初始发酵pH 值对青稞酒品质的影响见图5。

由图5 可知，相较于中性环境，较低的初始发酵pH 值更有利于酒精发酵和多酚组分的释放，随着初始发酵pH 值的增大，酒体中的总酚质量浓度和酒精度都呈现出先增加后降低的趋势，黄酮质量浓度基本保持稳定，但在初始发酵pH 值为6 时，酒体中黄酮质量浓度突然降低，这可能与中性环境下受到杂菌侵染有关。当初始发酵pH 值为3.5～5.0 时，酸性环境有效地抑制了杂菌的生长，保证有益菌的大量繁殖，红曲菌产生大量的淀粉酶、蛋白酶等水解酶系，将与多糖或蛋白通过酯键和醚键的形式连结的结合酚释放出来[20-21]；在初始发酵pH 值为4 时，红曲酒总酚质量浓度最高为1 602.32 mg/L，酒精度达到9.4%Vol，青稞酒醇香浓郁，感官评分最高达68.33 分，确定最佳初始发酵pH 值为4。

2.2.4 发酵温度对红曲霉发酵青稞酒的影响

发酵温度对青稞酒品质的影响见图6。

图6 发酵温度对青稞酒品质的影响

由图6 可知，随着发酵温度的提高，青稞酒中的总酚、黄酮质量浓度和酒精度先升高后降低。在29 ℃时，黄酮质量浓度和酒精度达到最高，但酒体中的总酚质量浓度低于32 ℃发酵酒。高温能够有效释放青稞中的功效成分及芳香物质，但当发酵温度高于29 ℃时，微生物在发酵初期产生大量的呼吸热，使发酵液温度急剧升高，达到36 ℃以上，过度的高温可能会使红曲霉提前老化，导致发酵不彻底，酒精度降低[22]，甚至使发酵液污染其他霉菌，影响成品酒的感官品质。因此，最适发酵温度应控制为29 ℃。

2.2.5 发酵时间对红曲霉发酵青稞酒的影响

发酵时间对青稞酒品质的影响见图7。

图7 发酵时间对青稞酒品质的影响

由图7 可知，随着发酵时间延长，酒体中的多酚和黄酮质量浓度都呈现出先增加后降低的趋势，酒精度则是随着发酵程度的加深逐渐增大，到发酵后期保持稳定。青稞酒酿造时发酵时间过短会使发酵不充分，糖类物质不能充分转化为酒精，影响酒体的品质，发酵时间过长，营养物质过度消耗，不利于红曲霉的生长繁殖，代谢产生不良产物，使酒变得浑浊，且易受到杂菌污染，酒体发酸。当发酵时间为15 d 时，红曲酒的总酚和总黄酮质量浓度分别为1 489.51 mg/L 和105.06 mg/L，高于其他发酵组，酒精度为9.6%Vol 达到最高。因此，确定红曲霉固态发酵青稞酒的时间为15 d。

2.2.6 正交试验结果

正交试验结果见表4，方差分析结果见表5。

表4 正交试验结果

表5 方差分析结果

由表4 和表5 可知，影响青稞酒中黄酮质量浓度的因素主次顺序为B＞A＞C＞D，其中加曲量对青稞酒中的黄酮质量浓度具有显著影响（p＜0.05），料液比和发酵温度对酒体中的黄酮质量浓度影响较小。此时，红曲霉固态发酵青稞酒的最优工艺条件为A2B1C1D1，即料液比1∶1.2（g∶mL），加曲量12.5%，发酵温度27 ℃，发酵时间14 d。

影响青稞酒中总酚质量浓度的因素主次顺序为C＞A＞B＞D，其中发酵温度对酒体中的多酚质量浓度影响较显著（p＜0.05），料液比和加曲量影响较小。此时，红曲霉固态发酵青稞酒的最优工艺条件为A1B2C1D3，即料液比1∶1.0（g∶mL），加曲量15%，发酵温度27 ℃，发酵时间16 d。

影响青稞酒中酒精度的因素主次顺序为C＞B＞D＞A，其中发酵温度、加曲量、发酵时间和料液比对酒体中的酒精度影响均不显著（p＞0.05）。此时，红曲霉固态发酵青稞酒的最优工艺条件为A2B2C1D2，即料液比1∶1.2（g∶mL），加曲量17.5%，发酵温度27 ℃，发酵时间15 d。

影响青稞酒感官评分的因素主次顺序为C＞A＞D＞B，其中发酵温度对酒体中的感官评分影响较显著（p＜0.05），料液比、发酵时间和加曲量影响不显著（p＞0.05）。此时，红曲霉固态发酵青稞酒的最优工艺条件为A1B2C1D3，与总酚质量浓度条件下的最优工艺一致。

2.2.7 验证试验

根据正交试验结果，选取高黄酮质量浓度组合A2B1C1D1，高总酚质量浓度和高感官评分组分A1B2C1D3，高酒精度组分A2B2C1D2进行验证试验。

验证试验结果见表6。

表6 方差分析结果

由表6 可知，在3 组验证试验中，A1B2C1D3组合的成品酒中总酚质量浓度为1 823.31 mg/L 显著高于其他2 个组合，此时青稞酒的黄酮质量浓度为127.00 mg/L，感官评分为82.2 分，达到最高，酒精度为8.53%Vol，略低于A2B2C1D2组合，说明此工艺条件下制备的青稞酒具有较强的抗氧化活性。A1B2C1D3组合的青稞酒中FRAP 铁还原能力、ABTS·清除能力和DPPH·清除能力分别为2 000.50 μmol/L，5 577.00 μmol/L 和1 202.11 μmol/L。因此，确定红曲霉固态发酵青稞酒的最优工艺条件为A1B2C1D3组合，即料液比1∶1.0（g∶mL），加曲量15%，发酵温度27 ℃，发酵时间16 d。

3 结论

青稞脱皮的层数及红曲米粉碎的方式等均对青稞红曲酒品质有一定的影响。结果表明，以3 次脱皮的青稞为原料，接种红曲粉、甜酒曲进行固态发酵，青稞红曲酒的发酵工艺为料液比1∶1.0（g∶mL），加曲量15%，发酵温度27 ℃，发酵时间16 d。在此优化条件下，青稞酒的总酚质量浓度为1 823.31 mg/L，黄酮质量浓度为127.00 mg/L，酒精度为8.5%Vol，感官评分为82.2 分，DPPH·清除能力为1 202.11 μmol/L，ABTS·清除能力为5 577.00 μmol/L，FRAP 铁还原能力为2 000.50 μmol/L。青稞酒产品色泽红润清透，酒体芳香浓郁、醇厚细腻、营养丰富，生物活性成分多酚质量浓度显著高于传统青稞酒，具有较强的抗氧化活性。